第二章+核酸的结构与功能

南方医科大学教案2010—2011学年秋季学期所在单位南方医科大学系、教研室基因工程研究所课程名称生物化学授课对象预防医学本科、中西医临床医学本科授课教师危敏职称副教授教材名称《生物化学》人卫第7版教案首页授课题目第2章核酸的结构与功能授课形式理论授课时间2010－09－20授课学时4教学目的与要求1．掌握核苷酸组成及化学结构2．掌握DNA的分子结构（一、二级及高级结构）3．掌握RNA的种类及三种主要的RNA的空间结构与功能4．掌握核酸的理化性质并了解其应用基本内容1．核酸的化学组成2．核酸的一级结构（重点）3．DNA双螺旋结构(重点及难点)4．DNA的超螺旋结构重点难点1．简述B-DNA双螺旋结构的特点？2．目前已知的DNA构型有哪些？各有何特点？3．DNA与RNA有哪些异同点？4．简述tRNA二级结构的组成特点及其每一部分的功能。5．DNA热变性有何特点，Tm值表示什么？主要教学媒体PPT主要外语词汇Nucleicacid;nucleotide;DNA;RNA;base;purine;pyrimidine;superhelix;nucleosome;exon;intron;Tm;hybridization有关本内容的新进展主要参考资料或相关网站1.《生物化学》，第六版，周爱儒主编，人民卫生出版社出版2.《现代医学分子生物学》，第一版，谷志远主编，人民军医出版社出版3.《生物化学》，李刚主编，科学技术文献出版社出版4.Harper’sBiochemistry，3rdEdition《Biochemistry》byChristopherK.Mathews&K.E.vanHolde.1990系、教研室审查意见符合大纲要求，同意实施。课后体会教学过程教学内容时间分配和媒体选择第三章核酸的结构与功能StructureandFunctionofNucleicAcid一、核酸的化学组成核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子。包括两类：一类为脱氧核糖核酸（DNA），另一类为核糖核酸（RNA）。DNA存在于细胞核和线粒体内，携带遗传信息；RNA存在于细胞质和细胞核中，参与细胞内遗传信息的表达。核酸的基本组成单质是核苷酸，而核苷酸又是由碱基、戊糖、磷酸组成。(一)碱基构成核苷酸的碱基主要有五种，分属嘌呤和嘧啶两类。嘌呤类化合物包括腺嘌呤A和鸟嘌呤G两种。嘧啶类化合物有三种，胞嘧啶C、胸腺嘧啶T和尿嘧啶U。嘌呤和嘧啶环中均含有共轭双键，因此对波长260nm左右的紫外光有较强吸收，这一性质可用于对核酸、核苷酸、及碱基进行定性定量分析。(二)戊糖与核苷、核苷酸戊糖是核苷酸的另一个主要成分，构成DNA的核苷酸的戊糖是β-D－2-脱氧核糖，而构成DNA的核苷酸的戊糖为β-D—核糖。即RNA糖环上2号碳原子处连的是-OH，而DNA此处连的是-H。表示碱基和糖环上各原子次序时，在碱基杂环上标以顺序1，2，3…；在糖环上标以l′，2′，3′…以作区别。碱基与戊糖通过糖苷键连接成核苷。连接位置是C-1′。核苷与磷酸通过磷酸酯键连接成核苷酸连接位置是C-5′。此处可连接一个、二个、三个磷酸基团，称为核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸。二、DNA的结构与功能DNA与蛋白质一样，也有其一级、二级、三级结构。（一）DNA的一级结构指DNA分子中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸的差异主要表现在碱基ppt上，因此也叫做碱基序列。四种核苷酸按一定排列顺序，通过磷酸二酯键连成主要核苷酸链，连接都是由前一核苷酸3′-OH与下一核苷酸5′-磷酸基形成3′-5′磷酸二酯键，故核苷酸链的两个末端分别是5′-游离磷酸基和3′-游离羟基，书写应从5′到3′。（二）DNA的二级结构即双螺旋结构模型，要与蛋白质的α-螺旋相区别。1．Chargaff规则DNA分子中腺嘌呤与胸腺嘧啶的含量相等，鸟嘌呤与胞嘧啶的含量相等；因此DNA中嘌呤与嘧啶的总数相等：即A＋G=C＋T2．双螺旋结构模型1953年Watson和Crick正式提出了关于DNA二级结构的右手双螺旋结构模型，主要内容有：（1）DNA分子由两条反向平行的多聚核苷酸链围绕同一中心轴盘曲而成，两条链均为右手螺旋，链呈反平行走向，一条走向是5′→3′，另一条是3′→5′。（2）DNA链的骨架由交替出现的亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成，位于双螺旋的外侧，碱基配对位于双螺旋的内侧。（3）两条多聚核苷酸链以碱基之间形成氢键配对而相连，即A与T配对，形成两个氢键，G与C配对，形成三个氢键。碱基相互配对又叫碱基互补。RNA中若也有配对区，A是与U以两个氢键配对互补。(4)碱基对平面与螺旋轴几乎垂直，相邻碱基对沿轴转36°，上升0．34nm。每个螺旋结构含10对碱基，螺旋的距为3．4nm，直径是2．0nm。DNA两股链之间的螺旋形成凹槽：一条浅的，叫小沟；一条深的，叫大沟。大沟是蛋白质识别DNA的碱基序列发生相互作用的基础，使蛋白质和DNA可结合而发生作用。DNA双螺旋结构要与蛋白质的相区别：DNA是两条核苷酸链通过碱基之间氢键相连而成，而蛋白质的α-螺旋是一条肽链自身盘曲而成，其氢键是其内部第一位肽键的N-H与第四个肽键的羰基氧形成的。（5）DNA双螺旋结构的稳定主要由互补碱基对之间的氢键和碱基堆积力来维持。碱基堆积力是碱基对之间在垂直方向上的相互作用，可以使DNA分子层层堆积，分子内部形成疏水核心，这对DNA结构的稳定是很有利的，碱基堆积力对维持DNA的二级结构起主要作用。3．DNA结构的多样性DNA右手双螺旋结构是DNA分子在水性环境和生理条件下最稳定的结构，但并不是不变的，当改变溶液的离子强度或相对湿度时，DNA结构会发生改变，除了Waston－Crick模型（B－DNA）外，还存在Z－DNA和A－DNA（三）DNA三级结构真核生物DNA分子很大，DNA链很长，但却要存在于小小的细胞核内，因此DNA必须在二级结构的基础上紧密折叠，这就形成了三级结构。超螺旋——原核生物DNA的三级结构绝大部分原核生物DNA是共价闭合的环状双螺旋分子，此环形分子可再次螺旋形成超螺旋，非环形DNA分子在一定条件下局部也可形成超螺旋。2.真核细胞基因组DNA真核细胞核内染色体即是DNA高级结构的主要表现形式。组蛋白H2A、H2B、H3、H4各两分子组成组蛋白八聚体。DNA双螺旋缠绕其上构成核心颗粒，颗粒之间再以DNA和组蛋白H1连成核小体，核小体再经多步旋转折叠形成棒状染色体，存在于细胞核中。(四)DNA的功能DNA的基本功能就是作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础。三、RNA的结构与功能DNA是遗传信息的载体，遗传信息的作用通常由蛋白质的功能来实现，但DNA并非蛋白质合成的直接模板，合成蛋白质的模板是RNA。正常细胞遗传信息的流向是：与DNA相比，RNA种类繁多，分子量相对较小，一般以单股链存在，但可以有局部二级结构。RNA分子比DNA分子小，它的功能多样，种类较多，主要有信使RNA、核蛋白体RNA、转运RNA、小核RNA及核不均一RNA等。各类RNA在遗传信息表达为氨基酸序列过程中发挥不同的作用。（一）信使RNA（mRNA）在细胞核内以DNA单链为模板转录生成hnRNA,hnRNA经过剪切变为成熟的mRNA,出核后在胞质内为蛋白质合成提供模板。成熟mRNA的结构特点：具有5′端帽子结构即在5′端加上一个7-甲基鸟苷；且原来第一个核苷酸C２′也是甲基化，这种mGpppGm即为帽子结构，2.3′端多聚腺苷酸尾在mRNA3′端有一段多聚腺苷酸节段，是在转录后切掉一段多余的RNA后逐个添加上去的，这个多聚尾可能与mRNA从核内向细胞质的转位及mRNA的稳定性有关。生物体内mRNA种类多，含量少，代谢活跃，在各种RNA分子中，mRNA半衰期最短，这是细胞内蛋白质合成速度的调控点之一。(二)核蛋白体RNA(rRNA)的结构与功能rRNA是细胞内含量最多的RNA，与核糖体蛋白共同构成核糖体——蛋白质的合成部位，参与蛋白质的合成。核蛋白体由大亚基和小亚基组成。1.原核生物：小亚基由16SrRNA和20多种蛋白质组成。大亚基由5S、23SrRNA与30余种蛋白质组成。2.真核生物：小亚基由18SrRNA与30余种蛋白质组成。大亚基由5S、5.8S、28SrRNA和近50种蛋白质构成。(三)转运RNA(tRNA)的结构与功能1.tRNA的一级结构tRNA是细胞内分子量最小的一类核酸，含有大量稀有碱基：如甲基化的嘌呤、双氢尿嘧啶、次黄嘌呤和假尿嘧啶核苷。tRNA的作用是携带相应的氨基酸将其转运到核蛋白体上以供蛋白质合成。2.tRNA的二级结构呈三叶草样二级结构：一些能局部互补配对的区域形成局部对链，不能配对的部分膨出成环状。此结构从5′末端起第一个环为二氢尿嘧啶环（DHU），第二个环为反密码子环，因其环中部的三个碱基可与mRNA中三联体密码子形成碱基互补配对，在蛋白质合成过程中解读密码子，把正确的氨基酸引入合成位点。第三个环为假尿嘧啶环（Tφ），所有tRNA3′末端为CCA-OH结构，与氨基酸在此缩合成氨基酰-tRNA，起到转运氨基的作用。3．tRNA的三级结构tRNA的三级结构呈倒L形。（四）其他类型的RNA如小核RNA（snRNA）参与hnRNA的加工。还有一类RNA分子本身具有自我催化功能，可完成rRNA的剪接。这种具有催化作用的RNA被称为核酶。四、核酸的理化性质及其应用（一）核酸的一般理化性质①核酸为多元酸，具有较强的酸性。②DNA是线性高分子，粘度极大，在机械力作用下易断裂，因此提取DNA过程中应注意不能过度用力，比如剧烈震荡吹打等。③由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共轭双键，使核酸分子在紫外260nm波长处有最大吸收峰，这个性质可用于核酸的定量测定。这要与蛋白质在280mm波长处有最大的吸收峰相区别，又因为分子生物学实验核酸提取过程中，蛋白质是最常见的杂质，故常用UD260/UD280来检测提取的核酸纯度如何。（二)DNA的变性、复性和杂交1．变性，这是DNA最重要的一个性质。①在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。DNA变性只涉及二级结构改变，不伴随一级共价键的断裂。②DNA的变性从开始到解链完全，是在一个相当窄的温度内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值增加达到最大增加值的50％时的温度叫做DNA的解链温度（Tm）。一种DNA分子的Tm值的大小与其所含碱基中的G＋C的比例相关也与DNA分子大小及变性条件有关，G+C的比例越高，DNA分子越长，溶液离子强度越高，Tm值越大。③加热、低盐及强酸、强碱均可使DNA变性。2．复性变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这种现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程也叫退火，一般认为，比Tm值低25℃的温度是DNA复性的最佳条件。3．DNA复性的实际应用——杂交：通过变性DNA的复性性质，我们可知道，DNA单链之间、RNA单链之间、一条DNA和一条RNA链之间只要存在序列互补配对区域，不管是整条链互补，还是部分序列互补，即可重新形成整条双链或部分双链，这即为核酸分子杂交，这在分子生物学研究中有极大的应用，比如：可用于在基因组中对特异基因的定位及检测，PCR技术扩增目的基因等，很多分子生物学实验技术应用的都是核酸分子杂交的原理，如SouthernBlot,NorthernBlot,包括PCR技术等。五、核酸酶指水解核酸的酶，根据底物不同分DNA酶、RNA酶，根据作用位点不同分核酶外切酶和核酸内切酶，其中限制性核酸内切酶在分子生物学技术中的应用尤为重要。