第二章固定化载体的筛选

第二章固定化载体的筛选固定化酶的载体材料是影响固定化酶性能的重要因素之一。酶的固定化载体通常需要具备的性质有以下几点：①带有能与酶发生反应的官能团；②具有大的比表面积和多孔结构；③不溶于水；④机械刚性和稳定性都非常好；⑤能防止微生物的降解作用。此外，还希望载体材料无毒、无污染、成本低廉、来源丰富。目前使用和研究中的固定化酶载体材料种类繁多，按其化学组成可以分为无机载体、天然高分子载体、合成高分子载体等。2.1实验材料2.1.1试剂表2-1实验试剂试剂名称级别生产厂家D-葡萄糖AR国药集团化学试剂有限公司酵母膏AR南京宁试化学试剂有限公司蛋白胨BROXOID琼脂AR上海化学试剂厂磷酸二氢钾AR广东·汕头市西陇化学厂磷酸氢二钠AR广东·汕头市西陇化学厂考马斯亮蓝G-250上海生工生物工程上海有限公司氯化钠AR上海四赫维化学公司异丙醇AR天津市福晨化学试剂厂离子交换树脂安徽三星树脂科技有限公司戊二醛ARSiama公司蔗糖AR西陇化工股份有限公司乳糖AR中国惠兴生化试剂有限公司乙醇AR无锡市亚盛化工有限公司氢氧化钠AR西陇化工有限公司浓盐酸AR上海中试生化2.1.2仪器表2-2实验仪器仪器名称规格与型号生产厂家酶标仪PowerWaveXS美国BIO-TECH公司恒温培养箱PYX-DHS-40*50-BS上海跃进医疗器械厂超净工作台SW-CJ-1B苏州净化设备厂2.2实验方法2.2.1β-呋喃果糖苷酶Fru6粗酶液的制备菌株：节杆菌AspergillusoryzaearilatensisNJEM01，本实验室筛选获得。工程菌E.coliBL21(DE3)/pET22b-fru6,本实验室构建。培养基：LB氨苄固体培养基（g/l）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，琼脂粉18，灭菌冷却后加入无菌的氨苄青霉素（Amp），使其终浓度为100ug/ml。LB氨苄液体培养基（g/l）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10,琼脂粉18，灭菌使用时加入无菌的氨苄青霉素（Amp），使其终浓度为100ug/ml。从冻存管中转接重组菌E.coliBL21(DE3)/pET22b-fru6于LB氨苄固体培养基上，37℃培养12h后，挑取一环菌于LB氨苄液体培养基中37℃，200r/mim,培养12h。以2%（v/v）的接种量接入50ml新LB氨苄液体培养基中于37℃，200r/mim培养2h后，加入IPTG致终浓度为1mmol/l，30℃诱导培养8h。培养结束后将培养液以5000/mim，离心15min，收集上清即为β-呋喃果糖苷酶Fru6粗酶液，4℃保存。2.2.2β-呋喃果糖苷酶Fru6酶活定义及反应体系反应体系：取离心后上清酶液50μl加入950μl蔗糖底物（1mol/l，PH6.47PBS缓冲）中，置于35℃反应30min，反应后煮沸10min。酶活力单位的定义为：35℃，PH6.47条件下，每分钟水解蔗糖底物（1mol/L）产生1μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位（U即umol/(ml.min)）。2.2.3固定化载体材料的筛选2.2.3.1大孔树脂的预处理（见图2-1）称取大孔树脂1g95%乙醇在30℃，200rpm摇床中浸泡2h加入5mlPH7的磷酸缓冲混合，在30℃，200r/mim摇床中放置12小时电子天平BP110SSartorias精密PH计ColeParmerColeParmerInstrumentCo.隔水式电热恒温培养箱PYX-DHS上海市跃进医疗器械一厂手提式压力蒸汽灭菌锅YXQSG41280上海医用核子仪器厂电热恒温干燥箱HG202-1南京实验仪器厂752紫外光栅分光光度计752上海精密科学仪器有限公司快速混匀器SK-1常州国华电器有限公司高速离心机TGL-16G上海安亭科学仪器厂取出烘干，预处理完成图2-12.2.3.2大孔树脂初步筛选大孔树脂树脂类型功能基团结构D301弱碱性阴离子交换树脂-N+(CH3)2苯乙烯-二乙烯苯D201强碱性阴离子交换树脂–N+(CH3)3苯乙烯-二乙烯苯D101大孔吸附树脂非极性交联聚苯乙烯AB-8大孔吸附树脂弱极性交联聚苯乙烯BS-65大孔吸附树脂非极性交联聚苯乙烯DM301大孔吸附树脂中极性交联聚苯乙烯表2-3大孔树脂称取D301、D201、D101、AB-8、BS-65、DM301六种树脂（见表2-3）各1g，经过预处理后与酶、戊二醛混合,放在200rpm、35℃摇床固定4h，测量酶活，选择合适的树脂类型。2.2.3.3弱碱性大孔树脂的筛选大孔树脂树脂类型功能基团结构D301弱碱性阴离子交换树脂-N+(CH3)2苯乙烯-二乙烯苯D311弱碱性阴离子交换树脂–NH2丙烯酸甲脂、D318弱碱性阴离子交换树脂–NH2丙烯酸甲脂D330弱碱性阴离子交换树脂-NH2、=NH、=N、=N-环氧系D345弱碱性阴离子交换树脂-NH2、=NH、≡N酚醛系表2-4弱碱性离子交换树脂称取D301、D311、D318、D330和D345五种弱碱性大孔树脂（见表2-4）各1g经过预处理后与酶、戊二醛混合,放在200rpm、35℃摇床里反应4h,固定完成，测量酶活选择合适的树脂基团类型。将301、D311、D318三种树脂的固定化酶循环反应5次，观察重复利用性。选出其中最好的载体。2.3结果和讨论2.3.1大孔树脂初步筛选图2-2：D301、D201、D101、AB-8、BS-65、DM301固定化效果从图2-2中可以看出，D301大孔弱碱性离子交换树脂固定化效果最好。D101等非极性树脂与酶进行吸附交联时，戊二醛不能与树脂交联，因此酶与载体的固定化方式仅仅是吸附，而我们的固定化体系是水相，酶的表面是亲水性氨基酸，吸附的酶在水相中容易从载体中脱离，固定化效果不理想。D201是属于强碱性阴离子交换树脂，而酶在强酸强碱中容易失活，所以固定化效果不及D301弱碱性树脂。所以弱碱性离子交换树脂可能适合于酶的固定化，我们选择其他4种弱碱性阴离子交换树脂，从中选择出最好的树脂。2.3.2弱碱性大孔树脂的筛选图2-3：D301、D311、D318、D330和D345固定化效果从图2-3可以看出，D301、D311和D318三种大孔树脂固定化效果要比D330和D345好。D301、D311和D318三种载体的表面都是伯胺基，而D330和D345两种载体上表面基团有伯胺、仲胺和叔胺，可能仲胺与叔胺不能与戊二醛发生交联，这两种载体的伯胺基少于其他三种，所以固定化效率不及带有伯胺基的树脂。因此我们实验选择带有伯胺基的大孔树脂作为固定化材料。接下来对第三种带有氨基的树脂进行重复批次实验，选择重复利用性好的树脂。图2-4D301大孔树脂重复利用性实验图2-5D311大孔树脂重复利用性实验图2-6D318大孔树脂重复利用性实验图2-7三种大孔树脂重复利用性（5批）从图2-4到图2-7四幅图中可以看出，在前五批批次上，三种树脂都具有很好的重复利用性，三种大孔树脂在第五批酶活开始下降，D311大孔树脂和D318固定化后，从第二批开始酶活都逐渐增加，可能固定化对酶有个激活的影响，D311大孔树脂在第三批开始酶活开始赶上D301大孔树脂，并且在后两批酶活都高于其他两种树脂，因此我们选择D311大孔树脂作为我们的固定化材料。