第二章工业微生物产物合成的酶调控和反应动力学

第二章工业微生物产物合成的酶调控和反应动力学1.发酵工程的组成从广义上讲，由三部分组成：上游工程、中游工程（发酵）、下游工程上游工程:优良菌株的选育、发酵条件的确定（pH、温度、溶氧和营养）、培养基等营养物质的准备下游工程产品分离纯化（固液分离、细胞破壁、蛋白质纯化）、包装处理（真空干燥和冰冻干燥）（一）微生物生长规律（典型细菌生长曲线）延滞期，对数生长期，稳定期，对数死亡期1.延滞期是微生物生长过程对外界的适应期菌体数目保持不变或略有下降，生长速率为0原生质均匀，嗜碱性强，DNA含量高代谢机能活跃，诱导酶类的合成最快2.对数生长期细胞的代时最短且恒定，群体细胞以几何级数增加，单位时间内细胞数目或细胞重量的增加（生长速率）恒定细胞分裂产生的所有菌都是活菌，总菌数与活菌数接近相等细胞的形态、生理特征一致在发酵工业中要设法延长此期，获得更多的活细胞。3.稳定期菌体的代时加长且不稳定，活菌数的增加与死菌数的增加接近平衡。原生质内出现贮藏物质，如糖原、异染颗粒、脂肪粒等，液泡，芽孢稳定期内代谢活动在进行，大量的次级代谢产物主要在此期形成。4.衰亡期（declineordeathphase）总菌数可以恒定，但活菌数逐渐减少细胞容易出现多形态，包括畸形，最后菌体自溶死亡在发酵工业中，由于活菌数大减，产物产生少，甚至破坏多，菌体自溶影响产物提取，及时结束发酵。（二）代谢产物的生源说与生物合成一、次级代谢产物基本特征二、次级代谢产物构建单位的生源说和生物合成1.次级代谢产物具有种特异性分类学上相同的菌种能产生不同结构的抗生素，如灰色链霉菌，既能合成氨基环醇类抗生素中的链霉素，又能合成多烯大环内酯类抗生素中的杀假丝菌素；分类学上不同的微生物也能产生相同的抗生素，如产生头孢菌素c的霉菌和链霉菌。2.分批发酵时，产生菌生长周期分为三个时期生长期、产物合成期、菌体自溶期三个时期中产生菌对营养成分和环境条件的要求不同，从生长期转化到生产期的过程中，菌体的生理特征和形态学都发生变化（DNA、RNA、蛋白质合成速率明显下降），次级代谢产物大量合成，直到高峰。3.次级代谢产物多为结构相似的混合物1）参与次级代谢产物合成的酶系的底物特异性不强，如产黄青霉菌能合成五种以上具有不同生物活性的青霉素（青霉素G、V、O、F、X）。2）代谢树现象：产生菌利用一种或两种以上初级代谢产物合成一种主要的次级代谢产物，产生菌继续对该产物进行多种化学修饰而同时合成多种衍生物。3）代谢网现象:一种次级代谢产物可由两种或两种以上的代谢途径合成。4.次级代谢产物的合成受多基因控制控制次级代谢产物合成的基因有的在染色体上，有的在质粒上，质粒在次级代谢产物合成中起着重要的作用。在深层培养中，由于环境的作用，质粒易丢失或丧失功能，导致次级代谢的不稳定性。按代谢产物与生长繁殖的关系分类：初级代谢产物：微生物产生的、生长繁殖所必需的代谢产物。如：氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖、核酸等。次级代谢产物：微生物产生的、与生长繁殖无明显关系的代谢产物。如抗生素、生物碱、多余的维生素、毒素、色素、生长刺激素（藤仓赤霉产生的赤霉素为植物生长刺激素）等。生源说：次级代谢产物分子中构建单位的各种原子的起源，实际上是有机化学问题。生物合成：各构建单位在多种酶的作用下合成次级代谢产物的过程，实际上是生物化学问题。次级代谢产物中间产物（C5、C4、C3、C2化合物）有的作为次级代谢产物的前体，有的经过微生物修饰后作为特殊前体三、次级代谢产物合成的基本过程构建单位：聚酮体、甲羟戊酸、糖类和氨基糖、不常见的氨基酸（非蛋白质氨基酸）、环多醇和氨基环多醇、非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱合成次级代谢产物的前体合成之后，这些前体就被引进途径特殊的次级代谢产物生物合成途径中，经过聚合等反应形成次级代谢产物。这些构建单位可缩合成聚酮体、寡肽、聚乙烯等，这些特殊的产物再经过多种多样的修饰，最终形成次级代谢产物分子。构成次级代谢产物的构建单位的种类和数量是不同的，有的由单一前体构成，绝大多数品种由两种以上的构建单位组成。次级代谢产物的分子骨架合成后，还要经过多种酶系的修饰才能获得最终产物。例如：四环素类抗生素的生物合成中，在完全闭环形成6-甲基四酰胺中间产物之后（分子骨架），经过C4位上氧化反应，C4位上氨化反应，C6位上的羟化反应，C4-NH2上的甲基化反应等多部修饰形成重要中间产物—脱氢四环素。金霉素链霉菌对此中间产物进一步修饰而形成四环素。龟裂链霉菌对此中间产物进一步修饰形成土霉素。次级代谢产物的积累同初级代谢产物一样受到合成途径中的某些酶活性的限制。酶活性的大小与产量呈正相关性。（三）微生物生物合成的主要调控机制一、次级代谢与初级代谢的关系1、概念初级代谢：在微生物的新陈代谢中，一般将微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程。次级代谢：是相对与初级代谢而提出的一个概念，指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程。2、代谢产物不同初级代谢产物：单糖或单糖衍生物、核苷酸、维生素、氨基酸、脂肪酸等，还有由它们组成的各种大分子聚合物，如蛋白质、核酸、多糖、脂质等生命必需物质。次级代谢产物：由初级代谢产物和分叉中间体形成，分子结构比较复杂，根据其作用可分为抗生素、激素、生物碱、毒素等，通常分泌到胞外。分叉中间体：菌体代谢过程中产生的某些中间产物，即可用于合成初级代谢产物，又可用于合成次级代谢产物。3、存在范围不同初级代谢的代谢系统、途径、产物在各类生物中都基本相同，它普遍存在的基本代谢类型。次级代谢只存在于某些生物中，具有种属特异性。4、功能不同初级代谢：能使营养物质转化为结构物质、具生理活性物质或为生长提供能量，是机体生存必不可少的物质，在这些物质的合成过程的任何环节发生障碍，或者导致生长停止或死亡，是最基本的代谢。次级代谢：对菌体自身的生命活动无明确功能，不参与细胞结构组成，也不是酶活性必需的，也不是机体生长和繁殖所必需的物质。5、合成时期不同初级代谢：自始自终存在与菌体中，同菌体的生长过程呈平行关系，只有微生物大量生长，才能积累大量初级代谢产物。次级代谢：是菌体生长至对数生长末期或稳定期产生的，它与机体的生长不呈平行关系。6、对环境的稳定性不同初级代谢对环境条件变化的敏感性小，遗传稳定性大.次级代谢产物对环境变化敏感，产物合成往往因环境条件变化而停止二、初级代谢产物生物合成中的主要调控机制——酶的活性调节；酶的合成调节；能荷调节1、酶活性的调节通过改变已有酶的活性来调节代谢速率。1）酶活性的激活：前体激活，多发生在分解代谢途径，既代谢途经中后面的反应可被该途径较前面的一种代谢中间产物所促进。2）酶活性的抑制：包括竞争性抑制和反馈抑制（正反馈/负反馈）。反馈抑制指反应途径中某些中间产物或末端产物对该途径中前面反应的影响。末端产物的反馈抑制作用普遍存在与合成途径，有两种以上的末端产物的分支代谢途径的反馈抑制，作用机制较复杂：协同反馈抑制累积反馈抑制增效反馈抑制顺序反馈抑制协同反馈抑制分支途径的几种末端产物同时过量时才抑制共同途径中的第一个酶活性。累积反馈抑制每一种末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中的第一个酶活性协同反馈抑制分支途径的几种末端产物同时过量时才抑制共同途径中的第一个酶活性。增效反馈抑制代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同反应途径中的第一个酶活性；但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和。顺序反馈抑制每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制作用。2、酶的合成调节通过调节酶合成数量来调节微生物的代谢速率。有诱导调节和阻遏调节。（1）酶合成的诱导根据酶合成与底物的关系分为：组成酶和诱导酶组成酶：是细胞固有的酶，合成受相应基因控制，与底物、底物类似物及环境条件无关，主要用于调节初级代谢。诱导酶：细胞为适应外来底物或底物结构类似物而临时合成的酶。如大肠杆菌在含乳糖的培养基上产生beta-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶。能促进诱导酶产生的物质为诱导物。底物、底物结构类似物及底物前体都可作为诱导物。底物类似物是出色的诱导物，它可使酶的合成数量成倍或几十倍的增加，但他们不能充作底物。如甲硫代半乳糖苷或异丙基硫代半乳糖苷不能被微生物作为碳源和氮源，但可诱导半乳糖苷酶系的合成达千倍。(2）酶合成的阻遏降解酶类通常是诱导作用和分解代谢产物来调节活性合成酶主要有反馈调节来控制：