第二章微生物发酵产酶

酶工程电子教案第二章微生物发酵产酶◆酶的生物合成：酶在生物体内合成的过程。◆酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。◆大多数酶的生产采用发酵生产→原因：微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点◆优良的产酶微生物具备的条件：（1）酶的产量高；（2）产酶稳定性好；（3）容易培养和管理；（4）利于酶的分离纯化；（5）安全可靠、无毒性等。◆酶的发酵生产的方式：固体培养发酵液体深层发酵固定化微生物细胞发酵固定化微生物原生质体发酵1.酶生物合成的基本理论◆蛋白类酶和核酸类酶→酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程◆合成过程:酶的基因（DNA）→（转录）→RNA→（翻译）→多肽链→（加工、组装）蛋白质1.1RNA的生物合成—转录（参考相应的生物化学与分子生物学课程知识）1.2蛋白质的生物合成—翻译（参考相应的生物化学与分子生物学课程知识）1.3酶生物合成的调节◆组成型酶（Constitutiveenzyme）：生物细胞中合成的酶的量比较恒定，这些酶的合成速率影响不大。如DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。◆适应型酶（Adaptiveenzyme）或调节型酶（Regulatedenzyme）：生物细胞中合成的酶的含量却变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌β-半乳糖苷酶。◆生物体为了适应环境的变化，使代谢过程有条不紊地进行，需要根据各种条件的变化，对各种适应型酶的生物合成进行调节控制。◇转录水平的调节◇转录产物的加工调节◇翻译水平的调节◇翻译产物的加工调节和酶降解的调节等◆转录水平的调节对酶的生物合成是最重要的调节1.3.1原核生物中酶生物合成的调节机制◆原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节◆雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）于1960年提出的操纵子学说（Operontheory）来阐明的。◇操纵子学说概述启动基因（Promotergene）：由两个位点组成，一个是RNA聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cyclicAMP,cAMP）与CAP组成的复合物(cAMP-CAP)的结合位点。操纵基因（Operatorgene）：与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。调节基因（Regulatorgene）:产生一种阻遏蛋白。阻遏蛋白是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合力。当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由于空间排挤作用，RNA聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，也无法进行结构基因的位置进行转录，酶的生物合成也就无法进行。结构基因（Struturalgene）：结构基因与多肽链有各自的对应关系。结构基因上的遗传信息可以转录成为mRNA上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链，每一个结构基因对应一条多肽链。◆操纵子（Operon）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操纵基因和启动基因。◇诱导型操纵子（Inducibleoperon）—大肠杆菌乳糖操纵子◇阻遏型操纵子（Repressibleoperon）—色氨酸操纵子(Trpoperon)(1)Trp作为辅阻遏物(corepressor)(2)阻遏物和RNApol在P,O重叠区产生竞争性抑制；(3)阻遏物的阻遏能力低，是LacR的1/千；(4)trpO调节合成代谢，存在衰减作用。色氨酸阻遏衰减子作用◇分解代谢物阻遏作用：是指某些物质（主要是指葡萄糖和其它容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。（葡萄糖效应、二次生长现象）（1）乳糖操纵子的启动基因内，除RNA聚合酶结合位点外，还有一个称为CAP-cAMP复合物的结合位点（2）cAMP是环腺苷酸，CAP是降解物基因活化蛋白（又称为cAMP受体蛋白，CRP），当CAP与cAMP结合后，就会被活化。（3）CAP-cAMP复合物又会激活启动基因，并使RNA聚合酶与启动基因结合。（4）乳糖与葡萄糖同时存在时，因为分解葡萄糖的酶类属于组成酶，能迅速地将葡萄糖降解成某种中间产物（X），X既会阻止ATP环化形成cAMP，同时又会促进cAMP分解成AMP，从而降低了cAMP的浓度，继而阻遏了与乳糖降解有关的诱导酶合成。1.3.2真核生物酶生物合成的调节◆目前为止，还没有统一的理论和模型来阐述真核生物酶生物合成的调节规律。◆真核生物细胞中酶合成的调节控制：从细胞分化改变酶的生物合成、基因扩增加速酶的生物合成、增强子促进酶的生物合成、抗原诱导抗体酶的生物合成等。2.常用的产酶微生物◆用于酶的生产的细胞必须具备几个条件：(1)酶的产量高(2)容易培养和管理(3)产酶稳定性好(4)利于酶的分离纯化(5)安全可靠，无毒性◆产酶微生物:细菌、放线菌、霉菌、酵母等。2.1细菌细菌是在工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中常用的细菌有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。(1)大肠杆菌（Escherichiacoli）大肠杆菌细胞有的呈杆状，有的近似球状,大小为0.5×1.0～3.0μm，一般无荚膜，无芽孢，革兰氏染色阴性，运动或不运动，运动者周生鞭毛。菌落从白色到黄白色，光滑闪光，扩展。大肠杆菌可以用于生产多种酶。大肠杆菌产生的酶一般都属于胞内酶，需要经过细胞破碎才能分离得到。例如，大肠杆菌谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸含量或用于生产γ-氨基丁酸；大肠杆菌天门冬氨酸酶，用于催化延胡索酸加氨生产L-天门冬氨酸；大肠杆菌青霉素酰化酶，用于生产新的半合成青霉素或头孢霉素；大肠杆菌天门冬酰胺酶，对白血病具有显著疗效；大肠杆菌β-半乳糖苷酶，用于分解乳糖或其他β-半乳糖苷。采用大肠杆菌生产的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等，在基因工程等方面广泛应用。(2)枯草杆菌（Bacillussubtilis）枯草杆菌是芽孢杆菌属细菌。细胞呈杆状，大小为0.7～0.8×2～3μm,单个细胞,无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏染色阳性。芽孢0.6～0.9×1.0～1.5μm,椭圆至柱状。菌落粗糙，不透明，不闪光，扩张，污白色或微带黄色。枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物，可以用于生产α-淀粉酶,蛋白酶,β-葡聚糖酶，5’-核苷酸酶，碱性磷酸酶等。例如，枯草杆菌BF7658是国内用于生产α-淀粉酶的主要菌株；枯草杆菌AS1.398用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。枯草杆菌生产的α-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外酶，而其产生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。2.2放线菌(actinomycetes)放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌(Streptomyces)。链霉菌菌落呈放射状，具有分枝的菌丝体，菌丝直径0.2～1.2μm。革兰氏染色阳性。菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子链。链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可用于甾体转化。2.3霉菌霉菌是一类丝状真菌。用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。(1)黑曲霉（Aspergillusniger）黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。例如，糖化酶，α-淀粉酶,酸性蛋白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纤维素酶，橙皮苷酶，柚苷酶等。(2)米曲酶(Aspergillusoryzae)米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生孢子头呈放射形，顶囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑，少数有刺，分生孢子梗长达2mm左右，粗糙。米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强，这使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用。此外，米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶P等。(3)红曲霉（Monascus）红曲霉菌落初期白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色。通常形成红色色素。菌丝具有隔膜，多核，分枝甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或成链，闭囊壳球形，有柄，其内散生十多个子囊，子囊球形，内含8个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢子则留在闭囊壳内。红曲霉可用于生产α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。(4)青霉(Penicillium)青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色，有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙，顶端形成帚状分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳，其内形成子囊和子囊孢子，亦有少数菌种产生菌核。青霉菌种类很多，其中产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素）果胶酶、纤维素酶等。桔青霉（Penicilliumcityrinum）用于生产5’-磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。(5)．木霉(Trichoderma)木霉属于半知菌纲。生长时菌落生长迅速，呈棉絮状或致密丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色，菌丝透明，有分隔，分枝繁复，分枝上可继续分枝，形成二级分枝、三级分枝，分支末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠粘液把它们聚成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒卵形。光滑或粗糙，透明或亮黄绿色。木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉生产的纤维素酶中包含有C1酶、Cx酶和纤维二糖酶等。此外，木霉中含有较强的17-α羟化酶，常用于甾体转化。(6)根霉(Rhizopus)根霉生长时,由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊包子。孢子呈球形、卵形或不规则形状。根霉可用于生产糖化酶、α-淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的11-α羟化酶，是用于甾体转化的重要菌株。(7)毛霉(Mucor)毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，无假根。菌丝体上直接生出孢子囊梗，一般单生，分枝较少或不分枝。孢子囊梗顶端都有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常有针状的草酸钙结晶。毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。2.4酵母(1)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)啤酒酵母是啤酒工业上广泛应用的酵母。细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽汁培养基上，菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊，每个子囊含有1～4个圆形光亮的子囊孢子。啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。(2)假丝酵母(Candida)假丝酵母的细胞圆形，卵形或长形。无性繁殖为多边芽殖，形成假菌丝，也有真菌丝，可生成无节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落呈乳白色或奶油色。假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。具有较强的17-羟基化酶，可以用于甾体转化。3.发酵工艺条件及其控制◆微生物发酵产酶的一般工艺流程如图2-7所示：图2-7微生物发酵产酶的工艺流程3.1细胞活化与扩大培养保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的固体培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复，这个过程称为细胞活化。活化了的细胞需在种子培养基中经过一级乃至数级的扩大培养，以获得足够数量的优质细胞。种子扩大培养所使用的培养基和培养条件，应当适合细胞生长、繁殖的最适条件。种子培养基中一般含有较为丰富的氮源，碳源可以相对少一些。种子扩大培