第二章目标产品的分析检测及质量控制

1/7第二章(1)目标产品的分析检测及质量控制蛋白质分析检测技术与质量控制按照美国食品与药品管理局（FDA）的要求，对于基因工程产品—蛋白质，除了确定其纯度外，还要对其物理化学性质进行表征，必须取得以下数据：分子量、溶解度、等电点、氨基酸序列、肽谱、二硫键配对，糖脂电泳谱图，二级结构、三级结构，与内源性物质的关系，受体的分布及结合等。基因工程产品生产过程中不允许有SDS参与。蛋白质的含量和纯度蛋白质的含量经典的方法：紫外法Lowry法BCA法：Pierce已有供应考马斯亮兰G-250纯度检测纯度要求：95%、99%，99.9%目标蛋白的分离、分析方法:凝胶电泳技术：聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS—PAGE、等电聚焦、二维凝胶电泳等电聚焦：不同的氨基酸组成不同的蛋白质，又不同的等电点。在偏离蛋白质等电点的介质中，蛋白质带负电或者带正电，此时，蛋白质会在电场作用下分别向正极或负极迁移，当达到其等电点的位置时，蛋白不带电，迁移停止，这就是等电点聚焦电泳的基本原理。等电聚焦电泳的关键取决于凝胶：IPG试剂—是拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种；丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，他们构成了pH3~10的缓冲体系。IPG胶：根据一定的配比，将IPG试剂以一定的比例加到混合物中用于凝胶聚合，从而形成不同pH值梯度的凝胶条。APE公司和BIO-RAD公司均有IPG胶商品出售。IPG胶的优点：机械性能好、重现性好、易处理、上样量大等优点，而且避免了电渗作用，可以进行特别稳定的IEF分离。二维电泳（2DE）基本流程：（1）第一向等电聚焦凝胶电泳（2）第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶（3）凝胶显色二维电泳（2DE）的优点分辨能力可达1万个点（30cm?40cm）分辨能力可达3000个点（20cm?20cm）。二维电泳得到的是构成蛋白质各个亚基的图谱，而非完整的功能蛋白质图谱。胶上蛋白检测的灵敏度取决于染色剂2DE存在的问题：低丰度蛋白的检测；极酸和极碱性蛋白的分离，目前最多能分离pH3~11范围内的蛋白质；高分子量区的蛋白分离困难（分子量大于10万）膜蛋白或疏水蛋白的分离困难操作过程难以实现自动化用于蛋白质、肽分离的色谱技术：反相色谱、离子交换色谱、疏水色谱、体积排阻色谱、亲和色谱、毛细管电泳、毛细管电色谱、毛细管电泳：以电场为驱动力，在毛细管中按溶质糖度或/和分配系数的不同进行高效、快速分离的技术。包括：毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、毛细管等速电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管电色谱分离的灵敏度取决于检测器：紫外检测器：pmol级；激光诱导荧光检测器：实现单分子检测；凝聚或核光散射检测器；质谱检测器；核磁检测器；色谱或电泳技术的特点：高效、快速，自动化程度高，定量准确，可直接与质谱联用进行定性分析虽然色谱或电泳技术可以克服凝胶电泳的很多缺陷，但在分离容量上还不及凝胶电泳。纯度的鉴定方法：聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS—PAGE、毛管电泳（CE）、等电聚焦（IEF）、HPLC（包括凝胶过滤、各种反向HPLC、离子色谱、疏水色谱等）、质谱法：电喷雾质谱（ESI），灵敏度Pmol、溶解度法：纯的蛋白质在一定的溶剂中具有恒定的溶解度，而不依赖于存在溶剂中未溶解固体的数量。注意：仅用一种方法鉴定蛋白质的纯度是不够的，至少利用两种以上不同分离机理的方法来判断蛋白质的纯度才比较可靠。蛋白质分子量的确定：凝胶筛分（体积排阻色谱）：测定完整蛋白质的分子量；SDS-PAGE：测定蛋白质亚基的分子量，用量约1g，误差：5-10%；毛细管电泳：分辨率和准确性高于SDS-PAGE，用量ng级；质谱：电喷雾质谱（ESI）、基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-TOF），精确度0.01%；等电点：等电聚焦法：既可以测定蛋白质的等电点，又可以鉴定蛋白质的纯度，是一种一举两得的方法。IEF—聚丙烯酰胺等电聚焦电泳cIFF—全液相毛细管等电聚焦电泳cIEF—毛细管等电聚焦电泳-电喷雾色谱技术分辨率极高，能分辨的等电点差异小于0.04pH单位。2/7肽谱及蛋白质序列测定：肽谱技术：是指蛋白质被酶或化学降解后肽段的分离分析或制备。1、裂解：酶裂解和化学裂解2、肽谱分析（指纹术）：SAS-PAGE、HPLC、CE、MS蛋白质序列：微量液相脉冲蛋白质/多肽自动顺序分析仪，灵敏度1pmol，检出极限为20fmol。LC-MS/MS对蛋白的全序列进行测定一般需要1-2天时间其它：1.蛋白质的二硫键分析：目前有同位素标记、化学修饰、质谱定位等方法来确定分子内和分子间的二硫键。2.蛋白质翻译后修饰的分析：蛋白质的磷酸化和糖基化等，主要使用质谱法确定。质谱法可通过特征离子监测的方法很快确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点。氨基酸的分析：HPLC：加柱前或柱后衍生装置；氨基酸自动分析仪；GC：需要柱前衍生化，使之可气化；CE。酶：对酶进行分离纯化一般有两方面的目的：1、为了研究酶的理化特性，需对酶进行鉴定，必须用纯酶；2、生化试剂和药物用酶，常常也要求具有较高的纯度。检查酶的活力及存在，不能直接用重量或体积来表示，常用它催化某一特定反应的能力来表示，即用酶活力来表示。1、酶活力和酶反应速度酶活力的大小可以用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的速度来表示。2、酶的活力单位（U，activeunit）：1个酶活力单位，是指在特定条件下（25℃，其它均采用最适条件），在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的量。3、酶的比活力（specificactivity）：比活力的大小，也就是酶含量的大小，即每毫克蛋白所具有的酶活力，一般用单位/毫克蛋白（U/mg蛋白质）来表示。糖：单糖：HPLC、GLC、MS、IR（红外）、NMR（核磁共振）、酶学检测及基于物理化学显色反应的检测。高效离子交换色谱气-液相色谱：灵敏度高，可分析nmol级的糖类化合物。用differentialextractivedistillation将单糖衍生化进而用气相色谱进行分离（FID检测器）。寡糖：TLC（薄层色谱）、CE、亲和色谱、离子交换色谱、毛细管电泳、红外、MS。糖蛋白：高效亲和色谱（用外源凝集素作为配基），对D-葡萄糖和D-甘露糖具有很强的专一性，也可用双向电泳和聚丙烯酰胺电泳来检测。脂类（Lipids）：脂肪酸（Fattyacids）；洗脱色谱（Elutionchromatography）；吸附色谱（Adsorptionchromatography）；离子交换色谱；离子排阻色谱；反向色谱；毛细管电泳；超临界流体色谱。检测器：电导检测器和示差检测器类固醇和抗生素主要采用反向色谱法进行分离。维生素反向、离子排阻等液相色谱法进行分离。蛋白质的失活机制及包含体的复性一、蛋白质的失活变性机制维持蛋白质生物活性的基础：一级结构:氨基酸序列高级结构：由氢键、范德华力、疏水作用及二硫键等决定。蛋白质失活变性的原因：1、一级结构被破坏,导致三维结构的变化,造成失活(肽键的酸水解和酶水解,二硫键被还原等）；2、如果一级结构没有变化,三级或四级结构变化也可能导致失活。引起变性的因素：温度、酸度、盐浓度、有机溶剂、蛋白酶的污染、蛋白质或酶的浓度等分离纯化过程中应采取的对策：1，添加蛋白质稳定剂：共溶剂（糖类、甘油和多元醇）、蛋白质（牛血清白蛋白）、抗氧化保护剂和还原剂（EDTA、谷光甘肽等）、底物、辅酶和活性因子（Ca2+等）、磷脂和脂肪酸、蛋白酶抑制剂2，优化操作条件：提供温和的实验条件、避免氧化失活、避免氧化酶水解和微生物污染。3/73，减少纯化步骤或优化纯化过程。二、包含体的复性基因工程产品目前的研发状况目前基因表达的重组蛋白质已达4000多种,其中用E.coli表达的要占90%以上,而这些蛋白质在E.coli中绝大多数是以包含体形式存在；用于临床的基因重组药物只有40余种。存在的主要问题复性效率低：常用的复性方法—稀释和透析法的复性效率为5~20%；与杂蛋白分离困难，产品成本高。包含体：一些利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白介素-6、人γ-干扰素等，不仅不能分泌到细胞外，反而在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1-3.0μm的固体颗粒-包含体。◎这些基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，但其立体结构是错误的，所以没有生物活性。包含体产生的原因：1、少量蛋白产生时是可溶的，其后积聚的量过多，在细胞内超过其溶解度而沉淀；2、蛋白的合成速度太快，肽链来不及折叠形成正确构象，导致分子间疏水基相互作用聚合而不溶；3、高表达的蛋白没有形成分子内正常的二硫键连接，这可能是由于肽键来不及形成正常的折叠构象而导致错误的二硫键连接，或者是高表达时细胞内氧化还原等条件不同而生成不同的二硫键连接；4、蛋白的溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱导形成适当的和可溶性的构象，当蛋白的产生过多，所需其他成分相对不足，蛋白质就不能溶解；5、包含体的形成也与蛋白质自身稳定性有关。◎如何使包含体复性？1，先用化学试剂将包含体溶解成为伸展的蛋白质一级结构；常用变性剂尿素、盐酸胍以及去污剂SDS等，可分别破坏蛋白质的高级结构及肽链之间的疏水作用，使其变成松散的水溶状态。2，使蛋白质的一级结构在合适的条件下重新折叠成正确的构象。◎蛋白质的重折叠机制1，蛋白质的重折叠的热力学和动力学特点2，蛋白质多肽链折叠的动力学模型聚集：是由暴露在溶剂中的疏水区相互作用的过程，速度快，一般在30秒内完成。复性：分子链内自我折叠的过程，相对缓慢，完全复性大约需10分钟的时间。(2)快速疏水折叠模型即处在极性水环境中的伸展多肽链，其疏水侧链基团为避开极性环境而引起多肽链快速折叠时，形成“溶球体”，再进一步折叠成“天然”构象。实现蛋白质重折叠的具体途径1，用膜透析法或凝胶过滤去除变性剂，也可采用稀释的方法，一般1~20mol/ml的低浓度条件下，重组蛋白的复性效果较好。4/7对小分子的多肽，复性效率较高，对大分子蛋白和二硫键较多的分子，复性很困难。2，加入分子伴侣人工分子伴侣体系(去污剂＋环糊精)环糊精与直链糊精辅助蛋白质复性分子伴侣：就是在细胞内催化及维持其他蛋白质正确构象的一类蛋白质，它参与细胞内许多蛋白质的折叠、聚合及跨膜运输，通过瞬时稳定其他蛋白质折叠中间体，阻止了蛋白质中间体聚集，帮助其形成正确的构象。环糊精的分子结构其复性过程分为两步进行：第一步为捕获阶段，在变性蛋白质溶液中加入去污剂，去污剂分子通过疏水相互作用与蛋白质的疏水位点结合形成复合体，抑制肽链间的相互聚集；第二步剥离阶段，加入环糊精，由于环糊精分子对去污剂分子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来，从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白质。环糊精的疏水性空腔能够结合变性蛋白质多肽链的疏水性位点，可以抑制其相互聚集失活，从而促进肽链正确折叠为活性蛋白质。直链糊精基本上能够模拟环糊精在辅助蛋白质复性方面的作用，而且具有这样一些优点：直链糊精的螺旋结构形成一个疏水性空管，可以结合更多的蛋白质分子；在水中溶解度较高，有利于提高复性酶浓度和实验操作；价格比环糊精便宜，实际应用前景较好。存在的问题：分子伴侣在实际应用中尚存在费用高并需要与复性蛋白质分离等缺点，目前，分子伴侣还处于研究阶段，没有真正用于工业规模的包含体复性。蛋白质的色谱复性及其纯化液相色谱是纯化蛋白质的一个必不可少的手段。其原理是根据待分离物质与色谱固定相之间作用力的不同而得到分离。利用色谱复性正是利用了变性的蛋白质在色谱固定相上的吸附作用而避免了分子间的聚集作用，在吸附-脱附-吸附的过程中实现了蛋白质的复性。◎色谱法进行蛋白质复性的优点是:①在进样后可很快除去变性剂;②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显地减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集,从而避免了沉淀的产生,提高蛋白质复性的质量和活性回收率;③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的,使复性和纯化同时进行;④便于回收变性剂,以降低废水处