第二节血液生化检验

第二节血液生化检验血液生化检验主要用血浆和血清。目前，在临床检验中多采用检验试条或试剂盒，或干式、湿式生化仪。根据仪器的自动化程度分为全自动生化仪和半自动生化仪。血液生化检验绝大部分都是使用仪器、试剂盒或试条检验。这里主要介绍部分检验项目的自配试剂和试验步骤。一、血糖测定血糖指血液中的葡萄糖，正常情况下糖的分解代谢与合成代谢保持动态平衡，血糖的浓度相对稳定，病理状态下血糖浓度的改变对于判断糖代谢的异常及相关疾病的诊断有重要意义。目前常用邻甲苯胺法测定血糖。（一）原理己醛糖溶液在酸性与加热情况下脱水生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛，再与邻甲苯胺缩合成芳香族第一级蓝色席夫氏碱，其颜色深浅与葡萄糖含量成正比。（二）试剂1．邻甲苯胺硼酸溶液：称取硫脲1.5g溶于冰醋酸883.2mL，再加邻甲苯胺76.8mL，混合后加入6%饱和硼酸溶液40mL，充分混匀，置于棕色瓶备用，可保存数月。饱和硼酸溶液：称取硼酸6g，溶于100mL蒸馏水中，放置一夜过滤即可应用。2．葡萄糖标准贮存液(1mL＝10mg)：精确称取葡萄糖1.0g，加0.25%苯甲酸(安息香酸)溶液至100mL。3．葡萄糖标准应用液(1mL＝1mg)：用0.25%苯甲酸溶液将贮存液作10倍稀释。（三）方法按表2.10操作。表2.10操作方法（单位：mL）标准管测定管血清—0.1葡萄糖标准应用液0.1—邻甲苯胺硼酸试剂5.05.0置100℃水浴加温5~8min，冷水冷却，在30min内用520~620nm滤光板比色，用蒸馏水做空白。（四）计算测定管光密度/标准管光密度×100＝白糖值(mg/100mL)。（五）正常值见表2.11。表2.11健康家畜血糖正常值（mg/100mL）动物平均值变动范围资料来源牛67.4652.76~84.89成都市乳品公司等犊牛60.6860.8~108.52成都市乳品公司等水牛58.0251.0~85.0江苏农科院绵羊35~60Kaneko仔猪(断奶)90.9048.50~133.80山西忻县地区牧医所马93.0068.00~118.00军需大学犬70~100Bloom猫77~118Bloom（六）临床诊断价值1.血糖升高(1)生理性或一时性升高如单胃动物饲后2~4h、精神紧张、兴奋、对动物的强制保定、疼痛以及注射可的松类药物等。(2)病理性升高见于糖尿病(犬、猫)、胰腺炎、酸中毒、癫痫、抽搐、脑内损伤，肾上腺皮质功能亢进、甲状腺功能亢进及濒死期等。2.血糖降低见于胰岛素分泌增多、肾上腺皮质功能不全、甲状腺功能减退、坏死性肝炎、肝炎后期、消化吸收不良性的胃肠炎、饥饿、衰竭症、慢性贫血、牛酮血症、母羊妊娠病、仔猪低血糖症、功能性低血糖症及毒物中毒等。二、血清钾测定(四苯硼钠比浊法)（一）原理血清中钾离子与四苯硼钠作用，形成不溶于水的四苯硼钾，它的浊度与钾离子的浓度成正比，根据浊度可测得血清钾的含量。（二）试剂缓冲液；1%四苯硼钠溶液；钾标准贮存液(1mL＝2mg钾)；钾标准应用液(1mL＝0.02mg钾)。（三）方法血清0.2mL加入重蒸馏水1.4mL，10%钨酸钠溶液0.2mL及2/3N硫酸溶液0.2mL，混匀。离心沉淀，取上清液按表2.12操作。表2.12血清钾测定操作步骤(单位：mL)步骤标准管测定管空白管无蛋白上清液—1.0—钾应用标准液(1mL＝0.02mg钾)1.0——重蒸馏水(mL)——1.01%四苯硼钠(mL)4.04.04.0混匀，5min后用520nm滤光板进行光电比色，以空白管调零，分别读取各管读数。（四）计算测定管光密度/标准管光密度×0.02×100/0.1=测定管光密度/标准管光密度×20＝钾(mg/100mL)血清钾(mmol/L)＝钾(mg/100mL)×10/39.1钾(mg/100mL)＝钾(mmol/L)×3.91（五）正常值见表2.13。表2.13健康动物血清钾正常值（mg/100mL）动物平均值变动范围资料来源乳牛19.7116.0～27.1西安市兽医院水牛20.0213.28～24.74扬州大学农学院绵羊21.0715.24～21.11Pugh猪18.8817.20～26.19Bertho等马12.91～25.11广州部队军马防治所犬17.08～22.09Robinson猫15.64～17.59Albritton（六）临床诊断价值动物体内绝大部分钾存在于细胞内，是维持细胞活动的主要阳离子。细胞外液中一定浓度的钾盐含量，是维持肌肉神经的功能所必需。钾盐由肠道吸收，约90%由尿液排出体外。某些疾病可因钾摄取量过少或排出量过多，或排泄障碍使钾盐潴积，或在体内分布失常而形成钾增高或减低。1.血清钾增高主要见于肾上腺皮质功能减退；临床上补钾超量；肾脏疾病(排钾能力下降)；组织遭受损害；酸中毒；休克；循环障碍；输血不当(引起血管内溶血，红细胞内的钾进入血液)；大量输注高渗盐水或甘露醇；脱水。2.血清钾降低主要见于给予利尿剂(尿钾排出增多)；长期使用较大剂量的肾上腺皮质激素，同时未能及时补钾；大量反复地输入不含钾盐的生理盐水等体液；代谢性酸中毒；严重腹泻或呕吐；肾上腺皮质机能亢进；脱水之后，大量饮水。三、血清钠测定(醋酸铀镁试剂法)（一）原理血清钠离子与乙酸铀镁试剂作用，生成乙酸铀镁钠沉淀，以亚铁氰化钾与试剂中剩余的乙酸铀作用，生成棕红色的亚铁氰化铀。血清中的钠含量愈高，则剩余的乙酸铀愈少，显色愈淡，反之则显色愈深。由剩余的乙酸铀量，可以间接计算出血清钠的含量。（二）试剂醋酸铀镁试剂；1%冰醋酸溶液；10%亚铁氰化钾溶液；钠贮存标准液；钠应用淡标准液；钠应用浓标准液。（三）方法按表2.14操作。表2.14血清钠测定操作步骤（单位：mL）步骤标准管测定管空白管血清—0.1—钠应用淡标准液0.1——钠应用浓标准液——0.1醋酸铀镁试剂5.05.05.0充分混匀，放冰箱内10min,2500r/min离心10min取上清液，分别注入另外3只试管0.10.10.11%冰醋酸溶液5.05.05.010%亚铁氰化钾溶液0.20.20.2混匀，5～30min内，以空白管调零，用520nm滤光板或绿色滤光板比色，读取各管光密度。（四）计算250-(测定管光密度/标准管光密度×100)=mmol/Lmmol/L×2.3=钠mg/100mL（五）正常值见表2.15。表2.15各种动物血清钠的正常数值（mg/100mL）动物平均值变动范围资料来源乳牛350.98338.1～373.98西安市兽医院水牛262.79±58.65扬州大学农学院牛319.7310.5～328.9Payne等绵羊319.7～349.6Pugh猪328.69±58.39扬州大学农学院马229.23242.53～355.93中国人民解放军军需大学犬335.8319.7～351.9Lane等猫351.9345～358.8Spector（六）临床诊断价值1.血清钠增高主要见于输入过量的高渗盐水；食盐中毒(常见于猪)；严重脱水；长期使用肾上腺皮质激素药物；某些慢性疾病(如充血性心力衰竭、肝硬化及肾病等，常同时伴有水肿)。2.血清钠降低主要见于持续性腹泻(胃液丢失，失钠大于失水)；肾脏疾病；大出汗；胸、腹腔大量产生渗出液(反复穿刺放液，钠盐从渗出液中大量丢失)；使用利尿剂；水中毒(见于犊牛)。四、血清氯化物测定(硝酸汞法)（一）原理以标准硝酸汞溶液滴定血清中的氯化物，用二苯卡巴腙作指示剂，硝酸汞与氯化物作用生成溶解而不离解的氯化汞。当滴定到达终点时，过量硝酸汞中的汞离子与二苯卡巴腙作用，生成紫红色的络合物。根据硝酸汞的用量，可求得样本中氯化物的含量。（二）试剂1mol/L氯化钠当量溶液；氯化钠应用标准液(10mmol/L)；0.1%二苯卡巴腙乙醇溶液；0.05mol/L硝酸溶液；硝酸汞溶液。（三）方法1.取小试管1只，准确加入血清0.1mL，加重蒸馏水1mL，混匀，再加0.1%二苯卡巴腙溶液1滴，此时混合液呈“肉红色”。加0.05mol/L硝酸溶液1～2滴，颜色随即消退。用装有硝酸汞溶液的微量滴定管进行滴定，待液体呈现紫红色时即为终点，记录用量。2．另取小试管1只，准确加入氯化钠应用标准液1mL，也用硝酸汞溶液滴定，待液体呈现与测定管相同的或近似的紫红色即为终点，记录用量。（四）计算滴定测定管消耗的硝酸汞溶液(mL)/滴定氯化钠标准管消耗的硝酸汞溶液(mL)×0.01×1000/0.1＝血清氯化钠(mmol/L)（五）正常值见表2.16。表2.16各种动物血清氯化物正常值（mg/100mL）动物平均值变动范围资料来源黄牛595.6487.64～704.28甘肃农业大学绵羊555.75～602.55Pugh猪602.55585.0～614.25Spector马622.80580.50～665.22中国人民解放军军需大学犬620.1579.15～643.5Spector猫702.0684.45～719.55Spector鸡171.34106.42～236.26甘肃农业大学（六）临床诊断价值1.血清氯化物增高主要见于代谢性酸中毒；猪的食盐中毒；肾脏疾病；咽炎、食道梗塞(饮水障碍，血液浓稠，氯化物相对性升高)；肾上腺皮质机能亢进；循环障碍(肾血流量减少，氯化物自尿中排出量下降)。2.血清氯化物降低主要见于严重的腹泻；大出汗；长期饥饿、拒食；胃肠道大手术之后(胃肠液大量损失)；肾上腺皮质机能减退；肝硬变(化)。五、血清钙测定(一)高锰酸钾滴定法1．原理血清加草酸铵使钙沉淀为草酸钙，以氨液洗去多余的草酸铵，再加硫酸使草酸游离，用标准高锰酸钾液滴定，计算钙的含量。2．试剂4%草酸铵溶液；2%氢氧化铵溶液；1mol/L硫酸溶液；0.01mol/L草酸钠溶液；0.01mol/L高锰酸钾溶液(1mL＝0.2mg钙)。3．方法（1）取血清1mL置于离心管，加蒸馏水3.0mL、4%草酸铵液1mL，混匀，静置30min，以3000r/min的速度离心10min。倾去上清液，将离心管倒置于滤纸上吸去管内残液。（2）加2%氢氧化铵溶液4mL于离心管内。以玻璃棒充分搅匀后，再离心沉淀5～10min，倾去上清液。用同样方法再洗涤一次，倒置离心管于滤纸上5min。（3）加当量硫酸溶液2mL，使管内沉淀物完全溶解。置于沸水中，使管内温度维持在75℃左右。（4）以1mL刻度吸管(最好用微量滴定管)，吸取0.01mol/L高锰酸钾溶液进行滴定，直至呈现微红色为止，记录滴去的0.01mol/L高锰酸钾溶液毫升数。4．计算钙（mg/100mL）＝测定管滴定用去毫升数×校正系数×0.2×100/1(二)EDTA滴定法1．原理血清钙离子在碱性溶液中与钙红指示剂(calcon)结合成可溶性的络合物，使溶液显红色。乙二胺四乙酸二钠对钙离子的亲和力大，能与该络合物中的钙离子结合，使指示剂重新游离在碱性溶液中显蓝色。故以EDTA滴定时，溶液由红色变蓝色时，即表示终点的到达。以同样方法滴定已知钙含量的标准液，从而计算出血清钙的含量。其反应式可简写为：EDTA=钠+Ca2+→EDTA钙+2Na+→2Na+2．试剂（1）钙标准液(1mL＝0.1mg钙)取碳酸钙少量，置蒸发皿中，于110～120℃干燥2～4h，移入硫酸干燥器中冷却。精确称取干燥碳酸钙250mg于烧杯中，加蒸馏水40mL及1mol/L盐酸5mL溶解，移入1000mL容量瓶，以蒸馏水洗烧杯数次，洗液一并倾入容量瓶，加蒸馏水稀释至1000mL。（2）EDTA溶液乙二胺四乙酸二钠150.0mg，1mol/L氢氧化钠溶液2.0mL，蒸馏水加至1000mL。（3）钙红指示剂称取钙红(2-萘酚-4-磺酸-1-偶氮-2-羟基-3-萘甲酸)0.1g，溶于甲醇20mL中。（4）0.2mol/L氢氧化钠液。3．方法按表2.17操作。表2.17EDTA滴定血清钙操作步骤*步骤标准管测定管空白管血清(mL)—0.2—钙标准液(mL)0.2——蒸馏水(mL)——0.20.2mol/L氢氧化钠液(mL)1.01.01.0注：*分别加钙红指示剂1滴，立即用EDTA溶液滴定，至溶液呈浅蓝色为止，记录各管