第五章发酵产物的分离纯化

第五章发酵产物的分离纯化下游加工亦称发酵后处理，是指从发酵液或酶反应中分离纯化目的产物并加工成成品的过程。第一节下游加工过程概述一、下游加工过程的重要性：1.获得商业产品的关键环节。2.拥有市场竞争力的重要保证。二、下游加工过程的特点1.发酵液是复杂的多相系统，属非牛顿液体，从中分离所需产品困难大。2.发酵产品在培养液中具有浓度低，稳定性差，对酸碱等外界环境十分敏感，容易失活。3.下游加工过程代价昂贵，产品回收率不是很高。4.发酵过程复杂，要求下游加工工艺应具有相当的适应性，以确保最终产品的纯度和质量。三、下游加工工程的一般流程1.发酵液的预处理和固-液分离。2.产物的初分离3.产物的高度纯化4.成品加工第二节发酵液的预处理与固-液分离一、发酵液的一般特征1.含水量高2.产品浓度3.悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大4.固体粒子可压缩性大5.液体黏度大，大多为非牛顿型流体6.产物性质不稳定二、发酵液预处理的目的和要求1.预处理的目的（1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率（2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体）（3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。2.发酵液预处理的要求:（1）菌体的分离（2）固体悬浮物的去除（3）蛋白质的去除（4）重金属离子的去除（5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除（6）改变发酵液的性质（7）调节适宜pH值和温度三、发酵液预处理的方法：1.重力法2.热处理法3.等电点法4.絮凝法1.重力法在工业上用的较多的主要是离心和过滤。过滤常用板框真空吸滤或电动筛等，离心和过滤能否顺利进行取决于很多因素。一般温度高，压力大，发酵液粘度小，滤布选用适当，助溶剂适宜，搅拌都可以提高过滤速度。2、加热法降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，降低悬浮物的最终体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度。不适用热敏性的物质3、等电点法调节溶液pH至等电点处，可使两性电解质所带净电荷为零，相邻分子之间由于没有静电斥力而趋于沉淀。适用于氨基酸、蛋白质和其他两性物质的沉淀分离。4.凝聚和絮凝法原理：电解质将胶体粒子表面上的电荷中和，减少存在于胶体粒子间的静电斥力，使范德华力占优势，这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子（凝聚）。或在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤（絮凝）。常用的凝聚方法：在稀溶液中加入电解质以促进凝聚。试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。常用的絮凝剂：明胶、甲基纤维素、多聚丙烯酸、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠影响絮凝的因素：絮凝剂的添加量、发酵液的pH、絮凝剂的分子量、搅拌转速、搅拌时间四、发酵液的相对纯化1.高价无机离子的去除去除钙离子：通常使用草酸。但由于草酸溶解度较小，不适合用量较大的场合，可用其可溶性盐，草酸价格昂贵，注意回收。去除镁离子：加入三聚磷酸钠，与镁离子形成络合物。用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。去除铁离子：可加入黄血盐，使其形成普鲁士蓝沉淀而除去。2.杂蛋白质的除去（1）沉淀法①蛋白质在酸性溶液中，能与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；②蛋白质在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。（2）吸附法加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。（3）变性法蛋白质由有规则的排列到无规则结构的变化过程成为变性。变性的蛋白溶解性小。使蛋白质变性的方法有：加热，调节pH，加酒精等有机溶剂或表面活性剂等。变性法的局限性：加热法只适合于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，并且要消耗大量酸碱；而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。五、固-液分离过程及设备简介意义：固-液分离过程下游加工的重要环节，用于发酵液的预处理和生物产品的纯化、精制等环节。方法：常用的方法有过滤、离心。此外还有膜分离、双水相萃取和扩张床吸附等方法。影响发酵液固-液分离的主要因素：菌体的大小、形状及发酵液的黏度，还有发酵液的温度、pH值、加热时间等。1.过滤：用过滤介质将悬液中的固形颗粒与液体分离的过程。常用的过滤方式：加压过滤和真空过滤典型设备主要有：板框压滤机和鼓式真空过滤机（1）板框压滤机1）优点：①板框压滤机的过滤面积大；②过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差；③结构简单，价格低；④动力消耗少等优点。2）缺点：①不能连续操作，设备笨重，劳动强度大；②卫生条件差；③非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。（2）鼓式真空过滤机1）优点：①能连续操作，②能实现自动化控制2）缺点：压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。2.离心分离：让液料再离心力场作用下促使其固形颗粒加速沉降已液体分子分离的过程。离心机按转速有常速、高速、超速三种。工业生产中常用的离心设备主要有：管式和碟式离心机。另一种常用的离心设备是倾析式（或称螺旋式卸料）离心机。（1）优点：①分离速度快，效率高，②操作时卫生条件好等优点，③适合于大规模的分离过程。（2）缺点：①投资费用高，②能耗较大。3.其他固-液分离方法（1）膜分离：利用不同组分通过膜的传递速度不同而得以分离的方法（2）双水相萃取：利用不同组分在双水相分配系数不同进行分离方法。（3）扩张床吸附：将固-液分离合目的产物吸附合并成一步进行的一种分离方法。六、微生物细胞的破碎2.常用的细胞破碎方法根据外加作用力的方式可分为机械法和非机械法两大类。可按所用方法的属性分为物理法、化学法和生物法三类。物理破碎法：高压匀浆法、挤压法、高速珠磨法、超声波法；化学破碎法：渗透冲击法、增溶法。生物破碎法：酶溶法（1）物理破碎法①高压匀浆法大规模细胞破碎的常用方法原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎。适用范围：适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。特点：在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。②挤压法（X-press法）将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃至-30℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出使之破碎。原理：细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。主要用于实验室中。优点：适用的范围广、破碎率高、细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高。缺点：对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。③高速珠磨法原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。优点：可连续操作缺点：破碎中产生的热量，需采用冷却措施。④超声波破碎法超声波破碎也是应用较多的一种破碎方法。通常采用的超声波破碎机在15-25千赫（kHz）的频率下操作。原理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。缺点：容易引起温度的剧烈上升，操作需要冷却。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。特点：杆菌比球菌易破碎，革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌易破碎，酵母茵效果较差。菌体浓度太高或介质黏度高，均不利于超声波破碎。应用范围：产生的热量不容易驱散．在实验室和小规模生产中是一种很好的方法。（2）化学破碎法：利用化学试剂改变细胞壁或膜的的结构或完全破除细胞壁形成原生质体后，在渗透压作用下使从而使细胞膜破裂而释放胞内物质的方法。优点：对产物的释出选择性好，细胞外形较完整、碎片少、核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。缺点：容易引起活性物质失活破坏；化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。特点：较温和的一种破碎方法，操作也简单。应用：仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。①渗透压冲击原理：将细胞放在高渗透压的介质中，达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。原理：利用某些化学试剂如有表面活性剂等，增加细胞壁或膜的通透性，而使细胞破碎的方法。②增溶法:该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。（3）生物破碎法常用的生物破碎法主要是酶溶法。利用生物酶分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。（2）外加酶法（2）自溶作用：是一种特殊的酶溶方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的，而不需要外加其它的酶。影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。应用：在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。2.破碎率的测定测定细胞破碎率的常用方法：①直接计数法②测定释放的蛋白质含量或酶活量③测定导电率第三节发酵产物的初分离一、沉淀法定义：通过改变条件或加入某种试剂，使发酵产物离开溶液，生成不溶性颗粒而沉降析出的过程。作用：浓缩作用大于纯化作用，是初步分离的一种手段。优点：沉淀法具有设备简单、成本低、原料易得、收率高、浓缩倍数高和操作简单等优点。缺点：于过滤困难、产品质量较低、需要重新精制。1.盐析原理：高浓度中性盐存在下，使生物分子在水溶液中溶解的溶解度降低而产生沉淀的方法，多用于蛋白质（酶）的分离。常用的盐类是硫酸铵。优点：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。（1）盐析机制①盐溶：[盐]低时，S（蛋白质的溶解度）随[盐]增加而增加；②盐析：[盐]高时，S（蛋白质的溶解度）随[盐]增加而降低；（2）溶解度与盐浓度的关系可用下式表示：logS=β－KS·IS：蛋白质的溶解度；I：离子强度；β：常数，与蛋白质种类有关，与盐的种类无关；KS：盐析常数，与盐种类有关，与温度和pH无关；①盐的种类：影响KS，KS越大，效果越好②溶质的起始浓度③盐析剂用量④温度和pH：影响β值而影响S。尤其是影响相对溶解度⑤杂质（3）影响盐析的因素2.等电点沉淀原理：利用两性电解质在在低离子强度下，调节至等电点，可使各种两性电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解度，形成沉淀。不同的两性电解质具有不同的等电点，从而将其分离开。优点：操作简单，试剂消耗少，引入杂质少。缺点：不能完全沉淀析出，常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。应用：主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。等电点操作时要注意：①溶液中离子的种类和浓度对生物分子等电点的影响。②等电点附近的盐溶作用③目的产物的不稳定性。等电点锌盐法3.有机溶剂沉淀定义：于水互溶的有机溶剂（乙醇、丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。多用于生物小分子、多糖、核酸和蛋白质等产品的提取。机理：降低溶液的介电常数，因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，溶解度降低。常用有机溶剂：乙醇、甲醇、丙酮等。缺点：容易引起蛋白质变性失活，并且有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。优点：①分辨能力比盐析法高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀；②沉淀不需脱盐；③有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离；④有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，适用于食品、药品的制备。4.非离子型多聚物沉淀定义：水溶性的非离子多聚物如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖右旋糖酐硫酸钠等，可用于沉淀分离蛋白质（尤其是不稳定的蛋白质）、DNA和RNA等。。机制：多聚物与有机溶剂相似，能降低水化度使蛋白质沉淀；与大分子形成复合物，发生共沉淀作用等应用最多的是PEG。优点：其操作条件温和，不易引起生