第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学

第五讲2中药及其制剂定量分析的方法学一、提取方法的选择由于在提取过程中参与因素较多，所以一般以正交设计试验筛选提取条件。(1)提取方式(2)浸泡时间(3)提取时间二、分析方法的选择用于中药含量的测定方法很多，在选用分析方法时，要根据被测成分的性质、干扰成分的性质等因素进行综合考虑。另外还要考虑方法的灵敏性、准确性和普及性。中药制剂含量测定大多需用对照品。(1)国家标准收载的含量测定用对照品(2)国家标准收载的定性鉴别用对照品(3)自制对照品，需经过结构确认、纯度检查和含量测定等几个步骤。三、测定条件的选择选择的原则要根据仪器性能和测试方法进行选择如化学分析中指示剂种类、指示剂用量及终点颜色的选择；可见分光光度法中显色剂种类、最大吸收波长、显色剂用量、最佳pH值、最佳显色温度、最佳显色时间及线性范围的选择；紫外分光光度法中最佳pH值、最大吸收波长及吸收系数的测定等；薄层扫描法中展开剂选择、显色剂选样、检测方式选择、最大吸收波长选择、仪器的线性比参数选择、测定方式、狭缝宽度、扫描宽度、灵敏度等；气相色谱法中固定相选择、检测器选择、内标物选择、柱效的测定、分离度测定等；高效液相色谱法中固定相选择、流动相选择、检测器选择、最大吸收波长选择（紫外检测器）、内标物选择、柱效的测定、分离度测定等。四、线性范围试验线性范围试验的意义范围试验目的有以下三种。(1)确定样品浓度或样品量与响应值是否呈线性关系(2)确定样品浓度或样品量的线性范围(3)考察标标准曲线是否通过原点，以便确定采用一点法或二点法定量相关系数r五、稳定性试验六、精密度试验RSD(七、重复性试验)八、耐用性试验九、灵敏度分析方法的灵敏度是指单位浓度（或量）与响应值的比值。检测限：以信噪比来确定检测限的最低水平。十、空白试验空白试验是消除测定过程中系统误差的一个重要手段。空白试验是在不加试样的情况下，按照试样的分析步骤和条件而进行分析的试验。在中药制剂分析中，因为常常是测量成药中某一味中药中的某一比学成分，要想得到真正的“空白”比较困难。所以常用阴性对照法。十一、回收率1．加样回收率即于已知被测成分含量的成药中再精密加入一定量的被测成分纯品2．以成药空白所做的加样回收率在成药空白(即除去欲测成分的药材后制成的成药)中加入一定量的被测纯品,依法测定。示例治伤软膏中苦参碱的含量测定■苦参为豆科植物苦参SophoraflavescensAit.的干燥根，具有清热燥湿，杀虫，利尿的功效。苦参中主要含生物碱类成分，有：苦参碱(Matrine)、氧化苦参碱(Oxymatrine)、槐定碱(Sophoridine)、槐果碱(Sophocarpine)、氧化槐果碱(Oxysophocarpine)等■本研究建立了HPLC法测定治伤软膏中苦参碱的含量，以控制治伤软膏的质量。1．试剂和仪器■ShimadzuLC-2010CHT高效液相色谱仪；CLASS-VPV6.14色谱工作站（日本岛津公司）■苦参碱对照品（供含量测定用），批号110805-200306；氧化苦参碱，批号110780-200306；槐定碱，批号110734-200303；氧化苦参碱，批号111652-200301，均购自中国药品生物制品检定所；■槐果碱，成都曼思特生物科技有限公司，HPLC纯度≥98%；2色谱条件的选择2.1固定相的选择■曾采用苯基柱、C8、ODS、硅胶柱、DIOL和氰基柱，苦参碱、槐定碱和槐果碱均不能达到良好的分离；■考虑到用反相色谱柱时，软膏基质影响色谱柱寿命■最终参考苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱的含量测定方法，选用氨基键合硅胶为固定相,本试验采用LichrospherNH2(4.6×250mm，5μm，江苏淮阴汉邦科技有限公司)色谱柱。2.2流动相的选择■采用氨基柱，试验了如下几种流动相系统，见表1。最终采用苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱含量测定用流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸，结合本药实际情况，将比例调整为84：9：7。表1流动相系统的选择流动相组成结果乙腈-无水乙醇-3%磷酸(80:10:10)苦参碱出峰太早，有干扰乙腈-无水乙醇-3%磷酸(84:9:7)苦参碱出峰时间合适，无干扰乙腈-无水乙醇-0.1%磷酸(TEA调节PH至2.5)(80:10:10)苦参碱出峰太慢2.3检测波长的选择■采用苦参国家标准中苦参碱、氧化苦参碱的含量测定用波长220nm。3前处理方法的选择■先后采用甲醇水浴提取法，乙醇水浴提取法，氯仿放置过夜提取法，氯仿振摇提取法，氯仿回流法，氯仿超声提取法。■甲醇、乙醇水浴提取方法简单，但提取出的成分复杂，干扰苦参碱的测定。■以氯仿作为提取溶剂提取率高且杂质干扰少，我们比较了以下几种提取方法：氯仿放置过夜提取法、氯仿振摇提取法、氯仿回流法、氯仿超声提取法。氯仿放置过夜提取和氯仿振摇提取法提取率均不高且操作不便，费时。通过比较，超声提取和回流提取测得的含量接近，因超声提取操作步骤简单，所以选择此方法处理供试品。3.1超声时间的考察表2超声时间的考察超声时间(min)2030405060苦参碱含量(%)0.0560.0600.0600.0650.0653.2冰浴时间的考察■为了防止软膏中脂溶性基质影响色谱柱寿命，采取冰浴的方式使脂溶性基质尽可能析出，再离心除去。表3冰浴时间的考察冰浴时间(min)2040506070测得含量(%)0.0560.0560.0560.0570.057试验结果表明：冰浴1小时以内不会造成样品含量降低考虑时间长有利于基质析出，最终确定为60min。3.3复溶溶剂的选择■曾选用甲醇作为复溶溶剂，图谱显示对苦参碱峰有干扰，采用流动相复溶没有干扰，所以选择流动相为溶剂。4测定法■色谱条件及系统适用性以氨基键合硅胶为填充剂；以乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液(84:9:7)为流动相；检测波长220nm。理论板数按苦参碱峰计算应不低于1500。■对照品溶液的制备精密称取苦参碱对照品适量，加流动相溶解，制成每1ml含苦参碱80μg的溶液，即得。■供试品溶液的制备取本品内容物约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，尽可能平铺于底部，加氨水1ml，充分浸润膏体后，精密加入氯仿50ml，密塞，称定重量，60℃超声处理（功率250W，频率40kHz）1小时，放冷，再称定重量，用氯仿补足减失的重量，摇匀，转移至分液漏斗中，分取氯仿层，滤过，精密量取续滤液25ml置100ml烧杯中，80℃水浴蒸干，残渣精密加入流动相10ml，密闭，超声3分钟，并时时振摇，所得溶液转移至10ml具塞玻璃离心管中，密塞，置冰浴中静置1小时，离心20分钟（4000转/分），取上清液作为供试品溶液。■测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。■本品每支含苦参碱（C15H24N20）不得少于10mg。5方法学验证5.1专属性试验①空白溶剂的制备流动相作为空白溶剂：乙腈-无水乙醇-3%磷酸（84:9:7）；②苦参碱对照品溶液的制备取苦参碱对照品约10mg，精密称定，置50ml容量瓶中，流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取20ml置50ml容量瓶中，流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，精密量取20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；③苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱混合对照溶液的制备分别取上述对照品适量，流动相溶解，摇匀，即得；④不含苦参的阴性对照供试品溶液的制备取不含苦参的阴性对照软膏内容物约2.5g，依“测定法”中供试品溶液的制备方法操作，即得；⑤软膏供试品溶液的制备5.2定量限■苦参碱对照溶液稀释浓度为每1ml含245ng的溶液时，色谱图中苦参碱的信噪比约为10，所以苦参碱的最低定量限为245ng/ml。5.3线性试验■精密称取苦参碱对照品12.25mg，置50ml量瓶中，加流动相溶解并稀释制成每1ml含245μg的溶液，作为贮备液；■分别精密量取贮备液2、5、10、12.5和20ml于25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得稀释液(1)、(2)、(3)、(4)和(5)。■分别精密量取各稀释液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定结果见表。C（μg/ml）19.64998122.5196245平均峰面积（A）187387481722961907120682919415452428906回归方程Y=9943.8X-8472.95.4精密度试验(1)重复性■取20071101批供试品，照“测定法”项下方法操作，一天内共分析6次，计算含量，结果见表。表5200071101批治伤软膏重复性试验考察分析次数123456含量(mg/支)18.118.518.718.417.718.2平均值(mg/支)18.3RSD%1.80(2)中间精密度■依“测定法”项下操作，甲乙两个操作人员在不同时间，用不同的仪器，每次独立测定苦参碱含量，计算中间精密度，结果见表6。表6中间精密度试验结果时间甲人员(mg/支)乙人员(mg/支)第一天(仪器1)18.518.4第二天(仪器1)18.618.9第三天(仪器2)19.019.1平均含量(mg/支)18.8RSD%1.82（3）进样精密度试验表7进样精密度试验分析次数123456峰面积913949915708913122914924911368912131平均值913534RSD%0.185.5回收率试验■取苦参碱对照品约21mg，精密称定，置50ml量瓶中，用纯水溶解并稀释到刻度，制成422.9μg/ml的对照品储备液。■取20071101批供试品的内容物约1.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，制备9份；分别精密加入苦参碱对照品储备液各1、2、3ml，制成75％、100％和125％三个浓度水平的供试品（每个浓度水平3份），按“测定法”项下测定，由重复性试验知道本批供试品苦参碱含量为0.06％，按下式计算回收率：■回收率％＝（测得总量-内容物含苦参碱量）/对照品加入量（mg）×100％回收率试验表明，三个浓度水平测定的回收率均在95.0%-105.0%之间表8苦参碱回收率试验软膏内容物称取量(g)对照品加入量(mg)内容物含苦参碱量(mg)测得总量(mg)对照品测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)75%1.26470.4230.7761.1830.40796.395.91.26570.4230.7771.1820.40595.71.26370.4230.7761.1810.40695.9100%1.26450.8460.7761.6060.83098.198.21.26070.8460.7741.6090.83598.71.26780.8460.7781.6060.82897.9125%1.26461.2690.7762.0601.284101.2101.11.26801.2690.7782.0581.280100.81.25101.2690.7682.0531.285101.35.6溶液稳定性试验表9苦参碱含量测定溶液稳定性试验结果时间(h)0246812峰面积895310910612922841918800922639932939平均值917190RSD%1.41结果表明：苦参碱供试品品溶液在12小时内稳定。5.7耐用性试验表10含量测定方法的耐用性变动因素测得含量(mg/支)流动相比例：乙腈-无水乙醇-3%磷酸(84.8:8.55:6.65)18.2流速：0.8ml/min18.8不同色谱柱：Lichrospher-NH2(4.6×250mm,5μm)18.8柱温：27℃18.66三批供试品的含量测定表113批供试品苦参碱量的含量测定批号200707022007110120071102含量(mg/支)18.118.018.9结果表明：每支软膏中含苦参碱约为18mg。规定本品每支软膏含苦参碱（C15H24N20）不得少于10mg。