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第五讲现代生物技术第一部分、基因工程遗传信息的奥秘DNA由4种核苷酸组成(ATCG)每3个核苷酸编码一个氨基酸基因就是DNA分子上含特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。（一）基因工程的概念克隆（Clone）：是无性繁殖的译音基因工程：是指在体外将外源DNA分子经切割和连接，插入至病毒、质粒或其他载体分子中，形成重组DNA分子，导入到受体细胞中，使外源基因在受体细胞中表达的过程。常用的宿主如大肠杆菌、酵母、动物(包括昆虫)和植物细胞。将目的基因转入微生物则成为工程菌；将目的基因转化于植物或动物则成为转基因动植物。理论上的三大发现★证明遗传物质是DNA★DNA分子双螺旋结构及半保留复制★中心法则及遗传密码的破译技术上的三大发明☆限制性核酸内切酶和DNA连接酶☆基因工程的载体☆逆转录酶的发现基因工程操作的工具酶根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为三大类：1.限制性核酸内切酶（内切酶）：将DNA分子在特定部位切开。2.DNA连接酶：将切割位点相同的两条链连接起来。3.DNA聚合酶：以母链DNA为模板，在引物的指导下，按母链核苷酸序列，将游离的核苷酸结合到相应的位置而形成互补的双链DNA。限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA分子的构建基因工程的载体基因工程的载体必须具备以下基本要求：1.在寄主细胞中能够独立复制；2.易从寄主细胞中分离纯化；3.有一段不影响自身扩增的非必需区域，使得插在其中的外源基因可以正常复制和扩增。基因工程的载体主要有六类：1.质粒载体：能自主复制；具有若干限制性内切酶的单一识别位点；有选择标记；较小的分子量和较高的拷贝数。2.噬菌体载3.柯斯质粒载体4.YAC载体5.BAC载体6.病毒载体：SV40通过感染方式将DNA送入哺乳动物细胞中。（二）基因工程的基本内容（重组DNA技术）重组DNA技术又称为基因工程（geneticengineering）或分子克隆（molecularcloning）基因工程的主要步骤：1.载体和目的基因的分离2.载体和目的基因的体外重组3.重组DNA转化受体4.重组DNA的筛选和鉴定5.克隆基因的表达(1)基因组水平的鉴定(2)转录水平的鉴定常用的方法Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交）RT-PCR检测mRNAcDNAPCR（3）翻译水平的鉴定为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。主要方法：Western杂交免疫检测（4）个体水平的鉴定1.根据重组体的表型进行筛选2.根据标志互补进行筛选转基因成功的条件：（1）外源基因的单拷贝插入和被插入受体基因组的被扰乱的“综合效应”；（2）转化后的受体能够长成可遗传的生物个体。（三）基因导入的方法植物材料：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、电激法等动物材料：脂质体转化法、显微注射、逆转录病毒、精子载体、电穿孔、磷酸钙介导法等。细菌材料：电激转化或转导（四）基因工程的应用1、基因工程药物基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质-肽类药物。基因工程药物（Geneticengineeringdrugs）：系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。基因工程药物的种类基因工程DNA重组药物主要成分为多肽或蛋白质类，大致可分为以下三大类：1.激素类及神经递质类药物：人生长激素释放抑制因子（humansomatotin)，人胰岛素（humaninsulin)，人生长激素（humangrowthhormone）2.细胞因子类药物：人干扰素（humaninterferons），人白细胞介素（humaninterleukina)，集落刺激因子（colony-stimulatingfactors，CSF)，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）3.酶类及凝血因子类药物：单克隆抗体、疫苗、基因治疗药物、白介素、生长因子、内啡肽、反义药物、人生长激素、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子等。重组原核微生物生产商品：结构独特、活性高、副作用小、成本低等优点真核细胞表达重组蛋白：正确的加工（形成正确二硫键、切割前体）、特异的翻译后修饰（蛋白质糖基化、对氨基酸的修饰）等优点基因工程药物中可能杂质与污染物基因工程药物中可能的杂质有残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素、蛋白质突变体和蛋白质裂解物等。主要污染物有微生物、热原和病毒等。主要检查项目有外源性DNA、宿主细胞蛋白质、其它有关杂质和细菌内毒素检查。目前世界上利用基因工程主要生产药物与疫苗，产值较高的有：胰岛素，生长激素，干扰素，乙肝疫苗等基因工程药物具有低成本，高回报的特点基因工程重组胰岛素干扰素生物药物（biopharmaceutics或biopharmaceuticals）是利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学等学科的原理与方法制得的天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物。生物药物主要包括生化药物（biochemicaldrugs）、生物技术药物（bio-technologydrugs)和生物制品（biologicalproducts)等。生化药物是从动物、植物及微生物等生物体分离纯化制得的生化基本物质，以及用化学合成、微生物合成或现代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、多糖、脂质、核苷酸类等。生物技术药物是利用生物体或其组成部分发展产品的技术体系，用现代生物技术研制的药物称为生物技术药物（或生物工程药物）。生物制品是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。2、植物基因工程转基因农作物的发展耐农药/抗虫能力：第一代转基因农作物Bt抗虫玉米传统玉米改变营养组成：第二代转基因农作物“黃金米”可以防治维生素A缺乏症生产医药与工业上应用：第三代转基因农作物植物转基因产业化的技术瓶颈问题1．基因资源的问题：I：功能基因和对应的调控元件匮乏；II：植物源和非植物源基因的区别；III：单基因与QTLs、cDNA与基因组序列的区别；IV：植物对环境的应答---转录调控过程并非“开”和“关”那么简单。从环境刺激到植物作出反应实际上是一系列复杂的信号传递过程，通过转基因技术给植物转入一个单基因，并不一定能对逆境基因的表达有很大影响，显著的提高逆境基因的表达可能需要对整个信号传递通路进行调控才能实现。2.基因转移技术的问题呼唤新的转基因技术——不依赖植物组织培养再生过程的转基因技术叶绿体转基因技术：技术过程：技术关键：3.转基因植物产业化技术集成和标准化3、动物基因工程转基因鼠的应用：动物模型、基因敲除、细胞功能、表达系统转基因动物：猪、奶牛、羊等动物乳腺生物反应器生产药物克隆动物4、基因工程菌在环境工程、食品生产中应用第二部分细胞工程细胞工程(cellengineering)是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖目的：获得新性状、新个体、新物质细胞工程的研究范畴动物细胞与组织培养植物细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体工程胚胎工程干细胞与组织工程转基因生物与生物反应器细胞工程的发展一、植物细胞工程（一）植物组织培养技术植物组织培养是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体，培养在人工控制的环境里使其再生形成完整的植株。植物组织培养过程要经过一个从分化状态到脱分化的愈伤组织（或悬浮细胞）中间形式，然后进入再分化和再生过程。意义加快繁殖系数低或种子繁殖困难的植物；快速而经济地繁殖苗木；经济安全地保存植物种质资源。优点可人为控制培养条件生长周期短、繁殖速度快管理方便，便于自动化培养材料经济培育无毒苗造林树种和经济林木：杨树、桉树、泡桐、棕榈生产脱毒苗木：对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后，就会代代相传越趋严重。对于植物病毒没有特效药，防止方法：（1）在田间早期拔掉病株，防止蔓延；（2）用杀虫剂消灭传播病毒的昆虫；（3）大多数植物病毒不侵入种子，可以用种子繁殖作物。植物茎尖培养脱除病毒原理（1）茎顶组织细胞的分裂速度比病毒移动速度快；（2）是茎顶组织内部还没有形成维管束或者维管束还未发达，病毒无法移动到茎顶部；（3）培养基中高浓度激素抑制病毒增殖。人工种子是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。人工种子技术有着诱人的前景它同微繁殖技术一样，培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的不利因素，且具有省地省工可直接在田间播种等优点。人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，这是微繁殖难以达到的。用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应器大规模培养，大大提高了效率。一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。人工种子应用于：（1）不稳定的基因型；（2）自交不亲合植物；（3）稀有珍贵物种；（4）人工授粉得到的杂种。人工种子由体细胞胚、人工胚乳和人工种皮三个部分组成。体细胞胚是制作人工种子的起始材料。一般要求是：发育阶段一致，呈游离状态，能大量得到，发芽率高。胚状体或芽诱导材料有：一般植物器官，愈伤组织，胚轴，原生质体等。产生体细胞胚是植物界的普遍现象，人工胚乳是包埋体细胞胚的胶状介质。缺点：营养物质易泄漏，保水性差，而且胶球很易粘连等。在胶球外包一层薄膜——人工种皮。既能透水透气又能防菌的人工种皮。人工种子距离实际应用还有很大距离主要有三大难题有待克服：①许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。②现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效地防止微生物的腐蚀。③人工种子的贮藏有待进一步完善。（二）植物体细胞杂交原生质体融合（三）植物细胞大规模培养植物次生代谢产物的生产。利用植物作为生物反应器，生产生物碱、抗菌剂、类固醇等物质。单细胞藻类的大规模培养成为植物细胞工程的重要组成部分微藻的优点：全身具营养价值、高蛋白含量、高产、节能、生产周期短、开发海洋资源、操作过程简易二、动物细胞工程内容包括：人工受精、胚胎移植、体外受精、哺乳动物孤雌生殖、双胞及嵌合体、性别选择、细胞融合、染色体及染色体组改造及转移、基因及细胞器的转移、单克隆抗体、动物细胞大规模培养、动物细胞反应动力学及动物细胞反应器等。（一）动物细胞培养技术生物技术：生产各种生物技术产品如：狂犬病、小儿麻痹症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。科学研究：病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。临床医学：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾病的治疗等。动物细胞生长特性细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素，细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差，需氧少，不耐受强力通风与搅拌群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）培养过程产品分布细胞内外，成本高原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡动物细胞的培养条件：温度：取材机体的正常温度人和哺乳动物细胞培养的最适温度为35~37℃。二氧化碳：氧饱和值在60%以下pH值在7.1-7.4之间无菌条件双蒸水3、动物细胞培养基液体，有维持液和生长液之分。其化学成分有：氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素及缓冲系统。维持液含低浓度或不含小牛血清，生长液含5%~20%小牛血清。动物细胞培养方法动物细胞可以自然合成或在外源基因指导下合成许多很有潜力的治疗药物。有的细胞本身就是产品，用于皮肤或骨髓移植、基因治疗等，某些有用大分子可以