第八单元染色与染料

第八单元染色与染料第一节染色的概念和目的用染液对组织(切片)进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色或深浅不一，产生不同的折射率，以利于(光学)显微镜观察和分析的过程称为染色利用染料在组织切片上给与颜色，使其与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分未加染色的切片在显微镜下除了能够辨认细胞和细胞核的轮廓以外，看不清楚其他任何结构即使由于组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明暗上能使我们看到一些组织结构，但也是极其简单而有限的。远远不能满足观察和诊断的要求我们不仅要通过显微镜视野来看到组织和细胞的形态结构，而且还要通过组织和细胞的形态变化来研究它的发生和发展.因此染色的技术才逐渐发展成为制片过程中的一个重要环节它较固定、脱水、包埋、切片等步骤远为复杂，理论性强，技术要求严格，已经成为一门独立的科学，它在组织学，病理学等学科中已占有相当的地位第二节染色的分类一、一般分类法通常有常规染色、特殊染色、细胞染色、组织化学染色、免疫组织化学染色和荧光染色等常规染色通常指病理学常规制片最广泛应用的苏木精-伊红染色法（H-E染色法），又称普通染色法组织细胞形态结构特点与病变，用常规染色法基本上都可以显示出来，故大多数组织病变用常规染色即可做出诊断或初步诊断在常规染色的基础上，为了专门显示特殊组织或其物质成分，证明或区分各种组织细胞、病变和物质的特点，可进行相应的特殊染色或其他染色二、按组织或成分分类包括结缔组织染色、肌肉组织染色、神经组织染色、脂类染色、糖原染色、粘液染色、色素染色、病理性沉着物染色、病原微生物染色、内分泌细胞染色、脱落细胞染色、核酸染色、酶染色和免疫组织化学染色等三、按染色方法分类有切片染色法、蜡带染色法、组织块染色法、大体标本染色法、整体染色法和涂片染色法等四、按染色的步骤分类单一染色法:用一种染液只染某种单一成分的染色（如用铁苏木精染睾丸生殖细胞）复染色法:用两种不同性质的染然料进行染色（如H-E染色）多色染色法:用三种或三种以上不同颜色的染色（如Mallory氏结缔组织多色染色法）五、按染料的浓、淡程度和用不用媒染物分类有渐进法与后退法、直接法与间接法此外还有金属沉淀法、活体染色法有按发明者的姓名命名、组织化学染色称为反应法第三节染色的原理一、基本原理染色就是利用染料在组织切片上给与颜色，使其与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分大多数染色的原理至今仍未搞清楚，通常染色剂与组织细胞相结合而使组织细胞着色的过程与化学反应和物理现象两者都有关系二、化学反应染料或组织都具有酸碱化学性质任何染料均可电离，离解出阳离子或阴离子酸性染料中的酸性部分有染色作用的是阴离子；碱性染料中的碱性部分有染色作用的是阳离子，细胞内同时含有酸性和碱性物质，酸性物质与碱性染料中的阳离子相结合如细胞核（含有核酸）、黏液和软骨基质呈酸性部分被碱性染料苏木精所染；反之碱性物质与酸性染料的阴离子相结合，如细胞质及其内部的某些颗粒物质被酸性染料伊红所染三、物理现象（一）吸附作用吸附作用是固体物质的特性，染液中分散的色素粒子受分子引力作用，吸附于被染物质的粒子间隙内而染色，如活性炭吸附毒气或色素（二）吸收作用染液中分散的色素粒子被组织吸收，并溶解于组织中而被染色，又称溶解作用，如用苏丹染料浸染脂肪，此种染色一般较牢固吸附和吸收统称为吸着此外还可有沉淀作用和毛细现象或渗透作用等第四节染料染料就是染色所用的试剂，又称染色剂这里所说的染料是指生物学用的染色剂，即专供染显微镜标本用的染料，较一般工业用的染料有效成分含量高、杂质少生物学所用的染料必须是生物学染色剂,有的是药用染料，有的是抑菌剂，还有一些是指示剂和化学试剂，一般通称为染料一、染料的性质（一）染料的一般性质及结构特点染料不仅要有颜色，而且对被染物和组织成分还必须有亲和力染料中应含有发色团和助色团1．发色团是使染料显色的化学团，即色原通常是能使有机分子产生颜色的含有不饱和键的基团；一般一种染料含一个或几个发色团主要的发色团有：偶氮基、亚硝基、硝基、羰基、乙烯基等染料颜色的深浅取决于发色团的多少、强弱发色团愈多其颜色愈深，强发色团（如偶氮基、亚硝基）一种染料中有一个即可呈色而其他弱发色团需有数个才能显色发色团分为碱性及酸性两种碱性发色团有偶氨基、嗪基、印胺基等；酸性发色团有硝基、亚硝基及醌型苯环等2．助色团是指使色原产生电离成为盐类对组织或其被染物产生亲和力的原子团通常是与发色团（不饱和键）及饱和烃相连的带有杂原子的饱和基团如氨基、二甲氨基、羟基、磺酸基等助色团能使染料分子颜色加深、极性加大，并与被染分子间形成亲和力只有发色团而无助色团时，因其对组织无亲和力故不能称为染料染料对组织的染色能力是发色团和助色团的共同作用（二）染料的酸碱性注意：不能与染液的酸碱性发生混淆（染料本身的酸碱性质既不是用来表明反应，也不意味着是属子酸类或碱类，一般都是盐类）一般是跟据助色团的性质来判定染料的酸碱性：所谓酸性染料是指含有酸性助色团的、能与碱作用生成盐的、其水溶液电离后为阴离子的染料所谓碱性染料是指含有碱性助色团的、能与酸作用生成盐的、其水溶液电离后为阳离子的染料最恰当的方法是把酸性染料和碱性染料分别改称为阴离子染料和阳离子染料二、染料的分类（一）按来源1.天然染料是从动物、植物中提炼出来的染料主要是苏木精、胭脂红、地衣红、番红花等2.合成染料多数是从煤焦油中提取的苯衍生物，品种繁多还有一些无机化合物，如硝酸银、氯化金、磺、锇酸、高锰酸钾等（二）按发色团的结构类型1.亚硝基染料：发色团为亚硝基（如萘酚绿-B）2.硝基染料：发色团为硝基（如苦味酸）3.偶氮染料：在苯环或苯环之间有一个或数个偶氮基发色团（如桔黄G，苏丹Ⅲ、Ⅳ，苏丹黑，油红“0”）4.醌亚胺类染料（如甲苯胺蓝，亚甲蓝，焦油紫，天青石蓝）5.苯甲烷类染料（如酸性复红，碱性复红，甲基紫，亮绿）6.吖叮类染料（如伊红Y、B，吖啶红，吖啶橙）（三）根据染料的主要用途1.细胞核染料苏木素、核固红、结晶紫、甲苯胺蓝等2.细胞质染料伊红Y、酸性复红、桔黄G、光绿、苦昧酸等3.脂肪染料油红“0”、苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ等4.纤维结缔组织染料苦味酸、丽春红、亮绿等（四）按染料的化学反应1.碱性染料含有碱性助色团一般作为细胞核染色剂，主要有：苏木素、甲笨胺蓝、亚甲蓝、碱性复红、甲基紫、中性红、甲基绿等2.酸性染料含有酸性助色团一般为细胞质染色剂，主要有：伊红、酸性复红、苦味酸、光绿、桔黄G等3.中性染料(复合染料)由碱性和酸性染料配制而成如血液涂片常用的Wright染液和Giemsa染液等三、常用主要染料的性质及用途（一）苏木精（素）苏木精是最早用于生物学上的天然染料之一，是从苏木树的树心中提炼出来的易溶于乙醇、甘油，也可溶于热水，属碱性染料其本身没有染色能力，须氧化（经自然或人工）成熟并加入含金属离子的媒染剂（如钾、氨明矾），才能达到染色的目的，由于配制染液初期和溶液的表面为紫蓝色，也称苏木紫因氧化成熟的溶液为红色，还称为苏木红在生产制作时加入氧化剂已经熟化的又称苏木因（二）伊红又称曙红、黄光伊红、黄光曙红，为红色粉末，是一种化学合成的酸性染料伊红Ｙ是常规苏木精染色的对比染色最常用的染料又分水溶性与醇溶性两种，病理组织学常规染色多用水溶性的水溶性伊红从字面上易使人误认它只溶于水而不溶于乙醇，其实只是溶解度大小不同而已其他常用染料（略）第五节媒染剂促染剂分化剂封固剂染色除要用染料外，还需以下试剂：一、媒染剂凡是有促进染色能力，对染料和组织都有亲和力并与染料和组织结合在一起的试剂称之为媒染剂常见的媒染剂有：硫酸铝钾、磷钼酸、铬盐、磷钨酸等二、促染剂凡是能促使染料对组织着色，增强染色能力，但本身不参与染色反应的试剂称为促染剂如（冰）醋酸（乙酸）等三、分化剂凡能有选择性地除掉组织切片上一定颜色的试剂或溶液，称为分化剂分化碱性染料可用稀的酸性溶液，而分化酸性染料则用稀的碱性溶液常用的分化剂有（一）氧分化剂：实际上是简单的漂白。如高铁氰化钾（二）酸性分化剂：能与媒染剂（金属）相结合形成可溶性盐类，从而打开了媒染剂和组织细胞的结合，使组织细胞脱色。如乙酸、盐酸（三）媒染分化剂：将已染色的切片再放到媒染剂的溶液中，则可使已经和组织相结合的染色剂脱去（四）具有脱水兼分化作用的分化剂脱水剂本身就是很多染色的分化剂，例如乙醇，特别是95％以下的乙醇就是伊红的分化剂（五）水及其他溶液的分化作用在多数染色方法中，一般在染色后都要蒸馏水或自来水及稀的醋酸水溶液冲洗。这一方面是为了清除残留在组织上面的染液和使切片清洁，而另一方面也是为轻度的分化四、封固剂（加盖剂、裱媒）封固剂能使染色后的组织切片被封藏在载玻片与盖玻片之间，使之不与空气接触，防止氧化褪色虽本身虽不参与染色过程，但具有保持色泽的作用；同时组织切片在封固剂的作用下，其折光率能和玻片的折光率相似，从而便于镜检。常用的有：（一）湿性封固剂此类封固剂使用方便，组织切片不必经过脱水、透明等步骤即可封固如甘油、甘油明胶（二）干性封固剂用于石蜡，冰冻和火棉胶切片的封固，使用时组织切片必须脱水，透明彻底如中性树胶第六节染色的一般问题及注意事项一、染色前的处理（一）脱蜡水洗凡是石蜡切片在进行各种染色之前都必须经过脱蜡水洗处理石蜡切片在染色前的脱蜡水洗处理必须彻底，尤其是于二甲苯内的脱蜡时间宁长勿短脱蜡水洗用的各级二甲苯和乙醇应经常更换新液（二）除掉组织切片内的汞盐沉淀物需要时（三）除福尔马林色素固定时间久的（四）铬化处理需要时二、染色问题及注意事项（－）溶媒问题配制染液的溶媒主要是蒸馏水，其次为乙醇，其他较少应用配制染液选择溶媒时，要注意染料的性质、染色作用及染色结果等如配制伊红染液时，水溶性伊红应用蒸馏水配制，而醇溶性的伊红则应用乙醇配制；如配制苏木精染液时，为使苏木精充分溶解，应注意到苏木精易落于乙醇，故先用乙醇使其溶解后再加入其他溶液内，有的需用水溶解的可以加温或充分搅拌方妥（二）染液的浓度第七节染色常用术语概念及说明一、脱蜡水洗常规这是在染色方法中常用的简略用语即指石蜡切片在染色前，必须经过由二甲苯溶解切片上的石蜡，再由高至低各浓度乙醇置换二甲苯，并逐渐加水，最后再用自来水及蒸馏水冲洗切片的常规方法之全过程二、脱水透明封固这是在染色方法中经常应用的又一简略用语组织切片在染色后，由低（95％）至高各浓度乙醇脱水，再用二甲苯置换乙醇，使组织呈现透明状态后，用中性树胶将组织切片封固于载玻片与盖玻片之间三、退行性染色与进行性染色退行性染色是用染液将组织过染后，再用分化剂有选择性地去掉不该着色的部分，使该着色的部分更加清晰适度（如H-E染色中，明矾苏木精的染色就是退行性染色，染色时使胞核及胞质都染上色了，然后再见盐酸乙醇分化）进行性染色是由于染料对组织某种特殊结构或物质有余合力，具有选择性着色的特点。染色时当染液将所染的组织成分染成适宜的颜色强度后，就终止染色，而勿需用分化剂进行调正色调的染色方法（如脂肪组织的苏丹染色）四、分化注意：不要与组胚的分化混淆指组织切片经染色（过染）后，用分化剂有选择地将不该着色的部分颜色除掉，使该着色部分的颜色适宜分化的不好，可使不该着色的组织成分还保持有颜色及该着色的色调过深如是分化过度，该着色的颜色很浅对于分化恰好适宜的，有的也称为分化好五、对比染色与复染将组织细胞的不同结构成分，用两种或两种以上颜色分别地显示出来其不同色调可用混合染液同时染色（V．G染色同时将胶原纤维与其他结缔组织及肌肉等染成不同颜色的对比染色）或用单一染液分别染色（如H-E染色就是胞核与胞质的对比染色，为两次分别染