第八章合子胚培养

1第八章合子胚培养1合子胚培养的概念1.1植物胚胎培养的概念植物胚胎培养是指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。目前，胚胎培养除了应用于育种工作外，还广泛被用来研究胚胎发生过程中的生理代谢变化以及有关影响胚发育的内外因素等问题。并且，在离体胚培养成功的基础上，又进行了胚乳、胚珠和子房的培养，特别是未受精胚珠或子房培养，为进行离体授粉(或试管受精)的研究提供了重要的技术条件。试管受精技术使克服远缘杂交中花粉与柱头之间的不亲和性成为可能。1.2合子胚培养的概念合子胚培养是指在无菌条件下分离和培养有性胚，以期获得可育植株的一种技术。1904年，Hannig最早在无菌条件下进行了离体胚培养实验，他当时所培养的是两种十字花科植物—辣根菜和萝卜的成熟胚。在含无机盐和蔗糖的半固体培养基上，Hannig成功将胚培育成可移栽的幼苗。随后，许多研究者从一些植物的成熟种子，特别是从败育导致种子不能萌发的植物中分离种胚，通过离体培养获得植株。依靠合子胚培养技术，现在已经能够挽救早熟败育的杂志胚了。2胚培养的类型离体胚培养可分为幼胚（未成熟胚）培养和成熟胚培养。离体培养中，这两类胚的成苗途径和所需营养条件也不太一样。2.1成熟胚培养2由于成熟胚生长不依赖胚乳的贮藏营养，只要提供合适的生长条件及打破休眠，它就可在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。所以，培养基只需含无机盐和糖即可。另外，成熟胚培养技术也要求不严，将受精后的果实或种子(带种皮)用药剂进行表面消毒，剥取种胚接种于培养基上，在人工控制条件下即可发育成完整植株。2.2幼胚（未成熟胚）培养幼胚指的是尚未成熟即发育早期的胚。它较成熟胚难培养，要求的技术和条件也较高。幼胚培养时，可能有三种生长方式：一是继续进行正常的胚胎发育，维持胚性生长，最终形成具有萌发能力的成熟胚；二是不能维持胚性生长，迅速萌发为幼苗，这种未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象称为“早熟萌发”(precociousgermination)。三是形成愈伤组织。由于早熟萌发形成的幼苗往往畸形瘦弱，甚至死亡。所以，进行幼胚培养时，关键是维持胚性生长。为了保证离体幼胚能沿着胚胎发生的途径发育，其对营养的需求较成熟胚复杂。另外，通过培养远缘杂交后的幼胚可获得远缘杂种。3合子胚培养方法3.1材料的选择与灭菌由于植物类型及实验目的的不同，幼胚培养对材料的要求也不一样。如果是一般的实验或示范，最好是先用一种胚易于剥离的植物如大粒种子的豆科和十字花科植物；如希望培养材料的胚发育时期具有一致性，应选择开花和结实习性有规律的植物，如荠菜具有总状花序，各个胚珠处于不同的发育时期，一般沿花序轴由上而下，胚龄逐渐增3加。每个蒴果含20～25个胚珠，且基本处于同一发育时期；如希望培养某一发育时期的胚，则须对刚开放的花进行人工授粉，并了解该植物授粉后的天数与胚胎发育的相应关系；如培养远缘杂种胚，则必须在其夭折前进行。取回大田或温室里授粉受精后的植物子房，用70％的酒精进行几秒表面消毒，再用0.1％氯化汞灭菌10-30min，用无菌水冲洗3～4次，即可用于胚的分离和培养。3.2胚的分离及培养3.2.1胚的分离一般来说，在进行胚的离体培养时，必须把胚从周围的组织中剥离出来。成熟胚只须剖开种子即可剥离，比较容易。但有些种子种皮很硬，须先在水中浸泡之后才能剖开。在剥取比较小的胚的时候则须借助解剖镜，并且在剥离出来后，要立即转入培养瓶中。对于幼胚的剥离，是把灭菌后的材料在无菌条件下切开子房壁，用镊子取出胚珠，剥离珠被，取出完整的幼胚，并置培养基上进行培养。由于植物的种类及发育时期的不同，幼胚分离的技术和难度也不一样(p160～161，荠菜和大麦的幼胚剥离)。3.2.2胚的培养对于成熟胚来说，由于其生长不依赖胚乳的贮藏营养，只要提供合适的生长条件及打破休眠，它就可在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。所以，培养基只需含无机盐和糖即可。另外，成熟胚培养技术也要求不严，将受精后的果实或种子(带种皮)用药剂进行表4面消毒，剥取种胚接种于培养基上，在人工控制条件下即可发育成完整植株。幼胚较成熟胚培养难，要求的技术和条件也较高。胚胎发育过程可分为两个时期：一为异养期(heterotrophyperiod)，即幼胚由胚乳及周围的组织提供养分；二为自养期(autotrophyperiod)，此时的胚已能在基本的无机盐和蔗糖培养基上生长。胚由异养转人自养是其发育的关键时期，这个时期出现的迟早因物种而异。在这两个时期之内，培养中的胚对外源营养的要求随胚龄的增加而逐渐趋向简单。在人工培养基上幼龄胚通常很难培养，尽管对培养基做了不少改进，胚在发育的极早时期仍发生夭折，幼胚很难培养成功。在这种情况下，利用胚乳看护培养，则可显著提高幼胚的成活率，因为植物正常的生长发育中，胚是由紧紧包围它的胚乳组织供给营养的。如进行大麦未成熟胚离体培养时，如果在其周围培养基上存在来自同一物种的离体胚乳，则对胚的生长有明显促进作用。有时异种胚乳对胚的生长比同种的更为合适，如进行谷类胚乳看护培养时，把大麦的胚移植到小麦胚乳上，其生长优于在大麦胚乳上。在大麦×黑麦的属间杂交中，若把杂种未成熟的胚放在事先培养的大麦胚乳上进行培养，可使30％～40％的杂种未成熟胚发育成苗，而传统的胚培养法只有1％的成功率。4影响胚培养的因素4.1培养基4.1.1无机盐5用于胚培养的无机盐配方很多，对其中每种成分的作用并无精确的评价。成熟胚培养中，主要采用一些较简单的培养基，如Tukey、Randolph、White等。幼胚培养的培养基主要有MS、B5、Nitsch、Rijven、White、Rangaswang、Norstog等。Monnier(1976)研究了几种标准的无机盐溶液(包括Knop、Miller、MS等培养基)对荠菜胚培养的作用，发现在一定的培养基上，未成熟胚的生长和存活之间并不存在相关性（p165，图10.6）。如在MS培养基中，未成熟胚的生长最好，但存活率却低；在Knop培养基中，虽然其毒性小，但胚的生长却较差。Monnier通过变动MS培养基中每一种盐分的浓度，配制了一种既有利于生长、也有利于存活的新培养基。在这种培养基上，胚的生长和存活都很好，与MS培养基相比，这种培养基中K＋和Ca2＋的水平比较高，而NH4＋的水平则低(p157表10.3)。另据Umbeck和Norstog(1979)报道，培养基中的NH4＋对于大麦未成熟胚的正常生长和分化是必需的。当以N03—作为无机氮的惟一来源时，500μm长的大麦胚在培养中只能略有生长，而这主要是由于细胞伸长造成的。盾片等的分化则需要有4.3～8.6mmo|／LNH4＋的存在。在曼陀罗和紫花曼陀罗中，对未成熟胚的培养来说，NH4＋或是必需的，或是一种较好的无机氮；另一方面，黄麻的胚则绝对需要硝态氮。4.1.2碳水化合物在离体的成熟胚和未成熟胚培养中，一般都需要有一种适当的碳源。迄今为止，蔗糖被认为是碳水化合物的最好形式，在胚培养中的6应用最为广泛。在胚培养基中加入蔗糖不仅是作为一种能源，而且是为了保持适当的渗透压，后者对于未成熟胚的培养来说尤为重要。最适蔗糖浓度因胚的发育时期而有所不同。成熟胚在含2％蔗糖的培养基中就能很好生长；幼胚则要求较高水平的糖浓度，如果浓度过低，会引起幼胚过早萌发。这是因为在自然条件下，原胚就是被一种高渗液体包围着的。适于原胚培养的蔗糖浓度一般为8％～12％。在长期的培养过程中，随着培养时问的增加，必须把胚转移到蔗糖水平逐步降低的培养基中。另有观点认为，胚在离体条件下的生长和分化在很大程度上并不依赖于渗透压的大小，而主要取决于某些生长调节物质的存在与否。如高渗透压阻止离体未成熟胚早熟萌发的作用可以用ABA有效地取代。4.1.3氨基酸和维生素在胚培养中加入氨基酸，无论是单一的还是复合的，都能刺激胚的生长。加单一氨基酸时，以谷氨酰胺最有效，如500mg／L的谷氨酰胺可促进多种植物离体胚的培养，1600mg／L的谷氨酰胺能强烈促进银杏胚形成的幼苗生长。水解酪蛋白(CH)是一种氨基酸复合物，一直被广泛用于胚培养。如水解酪蛋白和酵母提取物对荠菜及棉花心形胚生长有明显的促进作用，水解酪蛋白是四季橘很小的球形胚(14～28μm×14～28μm)的培养所必需的。胚对水解酪蛋白的敏感性因物种而异，栽培大麦最适浓度为7500mg／L；毛曼陀罗和曼陀罗的胚在含有400mg／LCH的培养基上长得最好；50mg／LCH能促进紫花曼陀罗胚的生长，但100mg／L时则有毒害作用。常用于胚培养的维生素类有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。维生素对发育初期的幼胚培养是必需的，而已萌发生长的胚，因其细胞能合成自身需要的维生素，维生素的加入可能对其形态发生有抑制作用。因而，最好是只有在通过实验证实了它们的必要性之后，再在培养基中加入维生素。硫胺素对植物胚培养的根伸长有促进作用，烟酸、泛酸钙和生物素则对茎生长的促进作用更为显著。4.1.4植物生长调节剂除了在某些植物中为了打破休眠以外，没有证据表明离体的成熟或未成熟胚的正常发育需要外源生长调节物质。实际上，生长素对于胚的生长通常表现抑制作用。Monnier(1978)建议，在胚培养基中不应加入植物激素，以免引起结构异常。他认为胚对大多数生长调节物质都是自主的。在这点上至少对GA3来说已在菜豆上得到了清楚的证明，其中胚柄可以满足离体胚对激素的需要。但是，如果为了由胚和胚段诱导愈伤组织，则通常都须在培养基中加入生长素或细胞分裂素，或二者都加。在大麦未成熟胚(500m长)培养中，若加入ABA，特别是当有NH4+存在的情况下，不但可以抑制由GA3和激动素所促成的早熟萌发，而且能使胚循序进行正常的发育。4.1.5天然有机物8正常植物体上，胚的生长受胚乳滋养，因此，加入一些天然的胚乳或种子提取物，对离体胚的生长有促进作用。20世纪40年代，VanOverbeek等使用椰子汁培养曼陀罗的心形胚获得成功后，人们广泛地在胚培养中使用椰子汁。使用多种天然提取物(大麦胚乳、麦芽、马铃薯块、大豆等提取物)进行大麦幼胚(0.5mm胚)培养，只有大麦胚乳可促进其生长，形成幼苗。在其他植物中也发现类似情况，如玉米胚乳组织的提取物可促进培养的玉米胚生长。Kent和Brink(1947)报道，海枣和香蕉的浸提物、小麦面筋水解物、牛奶和番茄汁(TJ)能够促进大麦未成熟胚的生长和抑制它们的早熟萌发。在上述这些物质中以番茄汁效果最好。此外，还发现蜂王浆对银杏幼胚正常分化有促进作用，并能减少培养胚的死亡率，抑制胚形成愈伤组织。4.1.6培养基的pH培养基的pH对胚的培养也有一定的影响。如荠菜胚珠液的pH值约为6.0，而其离体胚在pH值为5.4～7.5的培养基中都能正常生长。对紫花曼陀罗心形早期的胚培养最适pH值在5.0～7.5的范围内。8日龄的水稻胚在pH值5和9时，生长最好。Norstog和Smith(1963)报道，培养基的pH值对于大麦未成熟胚的器官分化是关键因素，最适值约为4.9。当pH值在5.2以上时，胚虽能生长，但不发生明显的分化。4.2培养条件4.2.1温度大多数植物胚培养的温度为25～30℃，但也有些植物需要较低9或较高的温度。如马铃薯胚培养时温度20℃较好，香子兰的胚在32～34℃下生长最好，柑橘、苹果、梨25～30℃是合适的，棉花胚32℃生长最好。有些植物，如桃的胚培养则需在变温条件下进行。4.2.2光照由于胚在胚珠内的发育是不见光的，所以一般认为在黑暗或弱光下培养幼胚比较适宜，光对胚胎发育有轻微的抑制作用。离体培养条件下进一步发育的幼胚对光的需求，因植物种类而异。棉花幼胚先在黑暗中培养，然后转入较强光照下培养，子叶的叶绿素生成很慢，但转人弱光下培养，子叶很容易产生叶绿素；荠菜胚培养，每天给予12h的光照比全黑暗条件好。4.3胚柄胚柄是一个短命的结构，长在原胚的胚根一端，当胚达到球形期时，胚柄也发育到最大。有关胚柄的结构、细胞学和生理生化的详细研究表明，胚柄积极参与幼胚的发育过程。一般胚柄较小，很难与胚一起剥离出