第八章维生素的测定

第八章维生素的测定本章涉及多种维生素测定方法，维生素的测定方法多种多样，故选取有代表性的脂溶性维生素VA/VE的测定及水溶性维生素的测定(VB2、Vc)。第一节概述维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。维生素都具有以下共同特点：这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；它们不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。测定维生素的意义：我们在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素的食品资源；指导人们合理调整膳食结构；指导制定加工工艺或贮存条件；最大限量地保留各种维生素，还要控制强化食品中加入量，防中毒，都离不开分析检测工作。维生素分类：脂溶性（A、D、E、K）、水溶性（B族、C）测定维生素的方法有：生物鉴定法、微生物法、仪器分析法、色谱法、化学分析法。维生素的单位表示：当维生素化学成分未清楚之前，往往无法用化学或物理方法加以测定，不能很好地表达这些物质的量和功效，所以必须通过生物实验检验出这种生物制品活性的高低，即所谓“效价”，把具有一定生物效能的最小效价定为一个国际单位。1IU=0.3μgVA=0.025μgVD=1.79μgβ-胡萝卜素=1.1mgα-VE=3μgVB=50μgVC第二节脂溶性维生素的测定VA、VD、VE、与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。脂溶性维生素具有以下理化性质：1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等非极性有机溶剂。2．耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定；维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。3．耐热性、耐氧化性：维生素A、D、E耐热性都好，维生素A、E耐氧化性差，特别是VA，易被氧化，而维生素D不易被氧化。一、脂溶性维生素的一般预处理方法——皂化：根据维生素的性质，测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品经水洗去除类脂物，有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)，浓缩，溶于适当的溶剂测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。一、维生素A的测定维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼肝油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。（一）高效液相色谱法测定食物中VA、VE即（GB/T5009.82—2003中第一法）高效液相色谱法测定维生素A/E是近几年发展起来的方法，此法能快速分离和测定视黄醇和它的同分异构体、酯及其衍生物。最小检出量分别为VA：0.8ng；α-E：91.8ng；γ-E：36.6ng；δ-E：20.6ng。1.原理：食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后，将其从不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用HPLC法测定维生素A及维生素E的含量。2.步骤：（1）皂化：称取1~10g样品（含维生素A约3μg)于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。加50mL10％抗坏血酸，苯并[e]芘标准液2.00mL，混匀。加10mL(50%)氢氧化钾，混匀。于沸水浴上回馏30min使皂化完全。皂化后立即于水中冷却。皂化完全的标志是加入10m1水，稍稍振摇，若无混浊现象，表示皂化完全。（2）提取：将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2~3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。（3）洗涤：用约50mL水洗涤分液漏斗中的乙醚层，水洗至水层不显碱性，（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。（4）浓缩：将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与球形蒸发瓶内，用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，入蒸发瓶内，接至旋转蒸发器上，于55°C水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入一小塑料离心管中，离心5min（5000rpm)。上清液供色谱分析。（5）色谱峰检测：高效液相条件：分析柱:ultrasphereODS5μm,4.6mm×25cm流动相:甲醇:水＝98:2混匀,于临用前脱气紫外检测器波长：300nm进样量：20μL流速：1.7mL/min（6）标准曲线的制备：将维生素A（维生素E）标准品配置成标准溶液（约1mg/mL），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。根据色谱图求出维生素峰面积与内标物峰面积的比值，从而查得或求得维生素含量。结果计算：X=（ρv/m）×100/1000式中：X——维生素浓度，mg/100g；ρ——标准曲线上查到的维生素含量，μg/mL；V——样品定容体积，mL；m——样品质量,g；（7）注意事项A、维生素A极易被破坏，应在微弱光线下进行，用棕色玻璃仪器。B、皂化过程每5分钟摇皂化瓶，使皂化完全。C、提取过程振摇不应剧烈，避免溶液乳化而不分层。D、洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。E、在旋转蒸发时乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量损失。F、用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低。（二）比色法测定VA的含量即（GB/T5009.82—2003中第二法）1.原理在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。2.适用范围及特点：本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于5~10μg／g)，对低含量样品，因受其它脂溶性物质的干扰，不易比色测定。该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在6S内滴定完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。3.操作步骤：（1）皂化：称取0.5~5g→捣碎或混匀→加入l0mL（50%）氢氧化钾及20-40ml乙醇→加热回流30分钟→皂化完全（检测方法仍然是加入10m1水，稍稍振摇，若无混浊现象，表示皂化完全）（2）提取：皂化液移入分液漏斗→用30mL水分两次冲洗皂化瓶→用50mL乙醚分两次冲洗皂化瓶→洗液并入分液漏斗→水层放入第二分液漏斗→再用30mL乙醚分两次冲洗皂化瓶→洗液倾入第二分液漏斗（反复洗水层）→水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗→如此重复操作，直到醚层不再使三氯化锑-三氯甲烷溶液呈兰色为止（不含VA）。（3）洗涤：在第一分液漏斗中→加入30ml水→分层后弃去水层→醚层加入15~20mL0.5mol／L的KOH溶液（碱液提取醚溶性酸皂）→弃去下层碱液→用水洗涤，至水洗液不再使酚酞变红为止→醚液静置l0~20min后，小心放掉析出的水。（4）浓缩：将醚液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中→用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内→水浴蒸馏，回收乙醚→减压抽干，立即准确加入一定量三氯甲烷(约5mL左右)，使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内(3~5ug／m1)。（5）标准曲线绘制准确吸取维生素A标准溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于6个10mL容量瓶中，用三氯甲烷定容，取6个3cm比色杯顺次移入标准系列使用液各1m1，各加1滴乙酸酐，以维生素A含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线。制备标准系列使用液→制成标准比色系列→调节光度零点→将标准比色系列按顺序移到光路前，迅速加入9mL三氯化锑-三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度(每支比色杯都在临测前加入显色剂)。（6）样品测定取二个3cm比色杯，分别加入1mL三氯甲烷(样品空白液)和1mL样品溶液，各加1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。分别测定样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出相应的维生素A含量。（7）结果计算C——由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量，ug/mLC0——由标准曲线上查得样品空白液中维生素A的含量，ug/mLm——样品质量，gV——样品提取后加入三氯甲烷定容之体积，mL100/1000——将样品中维生素A是由ug／g折算成mg／100g的折算系数（8）注意：A、维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。B、三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。C、显色物质不稳定，测定在6S内完成。二、维生素D的测定维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，具有维生素D活性的化合物约有l0种，其中最重要的是维生素D2、维生素D3及其维生素D原。维生素D2无天然存在，维生素D2只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7-脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。维生素D2食多中毒。测定方法（略）：(一)三氯化锑比色法(二)液相色谱法（教材P192自学）它的的灵敏度较比色法高30倍以上，且操作，简便，精度高，分析速度快。是目前分析维生素D的最好方法。是国标及AOAC选定的正式方法。第三节水溶性维生素的测定水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从小便中排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。水溶性维生素性质：水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。水溶性维生素一般预处理方法——酸解：•维生素C通常采用草酸、草酸-醋酸、偏磷酸-醋酸溶液直接提取。•维生素Bl、B2通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，再将它们从食物中提取出来。一、维生素B2的测定维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。GB/T5009.85—2003中第一法为荧光法，第二法为微生物法。（1）原理：核黄素在440~500nm波长光照射下发生黄绿色荧光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(Na2S2O4),将核黄素还原成无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。（2）酸提称取2-10g样品（约含10-200ug核黄素）于100ml三角瓶中，加入50mL0.1mol/L盐酸，搅拌直至颗粒分散均匀。用40mL瓷坩埚为盖扣住瓶口,置于高压锅内高压水解，10.3X104Pa30min。水解液冷却后，滴加1mol/L氢氧化钠，取少许水解液，用0.04%溴甲酚绿检验呈草绿（pH为4.5）（3）酶解——使核黄素游离出来含有淀粉的水解液：加入3ml10%淀粉酶溶液,于37~40℃保温16h。含高蛋白的水解液：加入3ml10%木瓜蛋白酶溶液,于37~40℃保温16h。过滤上述酶解液定容至100mL,用干滤纸过滤。此提取液在4°C冰箱中保存一周。（4）氧化去杂质视样品中核黄素的含量取一定体积的样品提取液及核黄素标准使用液（约含1-10ug核黄素）分别于20mL的带刻度试管中，加水至15mL。各管加0.5mL冰乙酸，混匀。加3%高锰酸钾溶液5mL，混匀，放置2min，使氧化去杂质。滴加3%