第八章重组DNA与现代生物技术

1第八章重组DNA与现代生物技术第一节农业生产中的应用转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面.1.抗虫转基因植物2.抗病转基因植物3.其他抗逆转基因植物抗除草剂抗冻番茄4.利用转基因改良植物的品质转基因赖氨酸玉米变色矮牵牛基因工程在农业上的应用：1）高产、稳产和具优良品质的品种用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。如“转基因高赖氨酸玉米”植株。2）抗逆性品种将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高寒等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。第二节重组DNA与药品生产美国批准上市的基因工程药品有人类胰岛素、人类生长因子、白介素、干扰素、牛型生长激素疫苗等。我国自1986年“863”计划实施以来，至2000年已有15种基因工程药物，3个基因工程疫苗和数十个重组诊断试剂投放市场。人用蛋白质药物传统生产的弊端：成本高；产率和产量低；原料易污染，不安全。基因工程药物可以克服传统方法生产蛋白药物的困难，原因：①可解决蛋白药物的产量问题，只需生长旺盛的表达系统；②微生物容易大量培养，能够降低成本；③基因工程生产人源的蛋白质药物安全、有效；④通过基因工程队编码基因改造以改造蛋白质结构，使之更稳定，活性更高，副作用更低。基因工程药物生产的主要步骤2一、分离编码蛋白药物的DNA或cDNA：①提取蛋白，纯化，测部分序列，推测编码序列，合成探针，从文库中筛选基因；②用已经纯化的蛋白质制备抗体，然后从表达文库中筛选二、优化基因表达的条件：①表达蛋白的功能；②表达量的多少一、人生长激素的生产人生长激素（hGH）是脑下垂体前叶分泌的蛋白质类激素，对人体除神经组织以外的所有组织（包括骨骼、肌肉、结缔组织、毛发和皮肤等）都有促进生长的功能。间接地还能促进脂肪和糖类的降解，增强蛋白质和核酸的合成作用。近年来的研究发现，生长激素在治疗侏儒症、烧伤、肥胖、出血性溃疡及在维持肌肉的活力、改善心脏功能、延缓衰老、防治骨质疏松、促进伤口愈合等方面均具有重要的作用。此外，对免疫系统也具有一定的增强作用。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。1979年，人类首次利用基因工程技术在大肠杆菌中表达了人的生长激素，1985年美国FDA首先批准了重组人生长激素上市。人们从450L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。应用DNA重组技术，在大肠杆菌中表达人生长激素，有两条不同的技术路线“其一是生产胞内型的重组人生长激素；其二是生产分泌型的重组人生长激素。技术关键是：构建能够在大肠杆菌细胞中表达人生长激素的表达载体二、影响我国生物制药产业发展的因素1.研发投入国外：2－3亿美元/基因药物国内：10多年来，对生物制药的总投入仅有40多亿元2.投融资与产业化模式国外：政府、企业、科研院所三位一体，大、中小企业结成战略联盟国内：政府、企业、科研院所各自为政或偶尔两两结合，投融资机制不健全3.市场竞争环境国外：市场竞争激烈，但秩序较好，市场份额多为大公司所垄断国内：仿制与重复建设、重复生产现象非常严重，出现了一哄而上的过热现象，市场恶性竞争，无法实现规模效益4.产品信誉国外：产品信誉较好国内：产品信誉低，“出现信洋不信中，买洋不3买中”现象5.创新与知识产权国外：创新意识高，特别注重知识产权（主要是专利、商标）保护国内：创新意识低，严重缺乏自主知识产权产品，当前，我国已产业化的21种基因工程药物和疫苗中只有3种拥有自主知识产权，其他均为仿制产品第三节蛋白质工程所谓蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。基本内容包括：一、按实际要求，周密审慎地设计新型蛋白质的氨基酸序列结构；二、通过基因克隆等程序，在适当的寄主细胞中表达比天然蛋白质结构和特性更加优良的新型蛋白质；三、分离纯化符合商业标准的新型蛋白质目前，主要集中在改造现有蛋白质这一领域。一般步骤：（1）分离纯化需改造的目的蛋白（2）对纯化的蛋白进行氨基酸测序、x射线晶体衍射分析、核磁共振分析等。3）通过蛋白结构设计核酸引物或探针，从文库中获取编码该蛋白的基因。（4）设计改造方案并进行改造基因序列。（5）把改造的基因片断插入适当的载体，表达产物。（6）分离纯化产物并进行功能检测。一、定点诱变策略定义：指在DNA水平上改变氨基酸的编码序列。实施前提：①要改变的基因编码区精确的核苷酸序列②要引入的氨基酸变化1.用M13DNA进行的寡核苔酸介导诱变这是进行定点诱变最常用的方法，利用了M13噬菌体生活周期中单链形式的存在。由于技术上的原因，采用这种方法通常只有I％一5％的噬茵斑含有突变的基因。因此，人们又对它做了各种改进。改进的用M13DNA进行的寡核苷酸介导的诱变2.寡核苷酸介导的PCR诱变4此方法不用把基因克隆到M13载体上，也不用为了提高突变率而使用dut-、ung-系统，而且不用将M13上的突变基因再亚克隆到表达载体上。但是需要合成两对引物。3.改进型双引物诱变把PCR技术应用于M13噬菌体上进行基因诱变。这种方法较为简便易行，且得到突变体的机率较高，因此是现在较常用的一种获得突变体的方法。4.重叠延伸诱变以线性DNA为模板，进行两次PCR。1.5简并寡核苷酸引物如果不知道要将原来的氨基酸突变为哪一种新的氨基酸，那么人们通常都采用在一点引入突变，产生所有可能的氨基酸的方法。这种方法有两个优点：①不要求知道特定氨基酸的功能；②可能有意想不到的收获。1.6随机诱变随机诱变就是在突变位置上随机地引入一种突变。缺点，即对每一个克隆都需要检测其蛋白的活性，找到所需蛋白后，再对其基因进行测序，只有这时才能确知是哪一个核苷酸发生了突变。寡核苷酸介导的基因突变应注意的各种因素（1）关于单链DNA模板的制备（2）关于寡核苷酸突变因误的设计和选择：a.引物尽可能避免重复序列及形成稳定的二级结构；b.引物突变碱基的两侧有足够长的互补序列；c.选用的寡核苷酸突变引物不能与载体上其他未点形成稳定杂合体；（3）关于突变引物与模板DNA的退火和引物延伸的条件：a.突变引物与模板DNA的比率；b.延伸反应（4）关于DNA聚合酶的选择二、定点诱变在蛋白质工程中的应用人们对酶、对蛋白质进行改造，目的是使它们更适合于工业生产。提高蛋白质的稳定性是工业生产中很重要的课题。一般来说提高蛋白的稳定性包括以下几个方面：①延长酶的半寿期；②提高酶的热稳定性：③延长药用蛋白的保存期；④抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。51.提高T4溶菌酶的热稳定性理论上，在没有二硫键的蛋白分子中导入二硫键可以提高蛋白热稳定性。在T4溶菌酶中只有两个半胱氨酸（Cys54和Cys97），但这两个半胱氨酸不能形成二硫键，经三维分析发现，第3位的异亮氨酸与第97位的半胱氨酸距离非常近，所以把异亮氨酸突变为半胱氨酸。2.对β干扰素（IFNβ）的改造人的β干扰素（IFNβ）的cDNA在大肠杆菌中表达，产物的抗病毒活性为106U/mg，只有天然糖基化蛋白的10%，而且虽然合成的β干扰素量很多，但多数以无活性的二聚体形式存在。人们分析发现，IFNβ有3个Cys，因此推测可能形成了不正确的二硫键。根据已知结构的类似蛋白IFNα，其分子中Cys29和Cys138形成了二硫键，该位置与IFNβ分子中Cys31和Cys141位置类似，所以推测IFNβ分子中的另一个Cys17可能带有游离的巯基，于是把它突变为Ser。3.改进α1抗胰蛋白酶α1抗胰蛋白酶是一种在肝脏中合成后被释放到血液的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其生理功能是保护组织免受弹性蛋白酶的消化作用。弹性蛋白酶是由嗜中性白细胞分泌的一种产物，可对肺造成损害，甚至发展成肺气肿。健康人体中，当α1抗胰蛋白酶通过与弹性蛋白酶发生不可逆的结合，便会在其358位的甲硫氨酸和359位的丝氨酸间被切割，同时使后者活性受到抑制，经过这种切割后，复合物便难以解离，从而通过血液排出体外。α1抗胰蛋白酶358位的甲硫氨酸非常容易氧化成甲硫氨酸亚砜，氧化后由于分子过大无法嵌到弹性蛋白酶的活性部位，失去了结合能力。应用定点诱变技术把α1抗胰蛋白酶的第358位的甲硫氨酸置换成缬氨酸，便可获得抗氧化的α1抗胰蛋白酶突变。4.组织型纤溶酶原激活剂的改造组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是人体各种组织均可合成的一种丝氨酸蛋白酶。它能切割纤溶酶原形成纤溶酶，来分解血栓。所以重组的人tPA在临床上用作溶栓剂。天然的tPA半寿期仅有5分钟，在治疗中难以持续地发挥药效。作为一种糖基化蛋白，很容易为肝脏受体所特异识别，于是将其分子中120位的天冬酰胺换成谷氨酰胺，半寿期大大延长。5.对其他的定点改造a.改变酶的活性b.对水蛭素的改造c.对人的生长激素的改造6d.胰岛素的蛋白质工程第四节抗体工程哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体(antibody)；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原(antigen)。抗体：由B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一类与相应抗原特异性结合，具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白IgG的基本结构图抗体分子的酶切片段一、抗体的结构一个抗体分子(即免疫球蛋白)通常包括两个完全相同的轻链分子(L)和两个完全相同的重链分子(H)，这4条链在氢键和二硫键共同作用下连在一起，形成一个“Y”字型结构。可变区（V区），恒定区（C区）二、抗体的功能Fab片段保存有抗原结合活性和特异性，与Fab片段不同，Fc片段没有抗原结合活性，但它是抗体结合上抗原后激活机体免疫反应的主要部位，它主要激活以下免疫反应：①激活补偿功能系统，该系统可分解细胞膜，激活巨噬细胞，并且产生信号以激活免疫反应系统的其他组分。②产生抗体依赖性细胞介导毒性（ADCC）。③Fab区域结合一个可溶性抗原后，抗体的Fc部分可结合巨噬细胞的Fc受体，使巨噬细胞吞食并毁灭抗原—抗体复合体。三、单克隆抗体抗原决定簇：抗原的某些部分，比大分子小得多的有特异性的化学基团，有的仅有6、7个氨基酸组成。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。单克隆抗体：由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。1.杂交瘤细胞系的产生7注意：在制备单克隆抗体时，提供骨髓瘤细胞的动物和进行免疫反应制备B细胞的动物最好来自同一品系。筛选标记:HAT培养基；次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）选择系统2.杂交瘤细胞的鉴定收集培养基加到另一个预先包埋好目标抗原的培养板上，清洗，加入二抗，通常在二抗上连有一个酶，可使一种无色底物变成有色物质，如果某个培养孔出现了颜色，就说明该培养基中含有对抗原特异的抗体。三、单克隆抗体的改造及应用人们可以利用杂交瘤技术连续生产纯化的单克隆抗体，抗体现在已被人们视为是一种有效的药物。面临的问题：交叉反应产生免疫反应及过敏反应。现在的目标是获得高药效低免疫性的人类单克隆抗体。1.单克隆抗体靶向制剂靶向制剂：指借助载体、配体或抗体将药物通过局部给药、胃肠道或全身血液循环而选择地浓集于靶组织、靶器官、靶细胞或细胞内结构的制剂。制备单克隆抗体靶向制剂的方法主要有三种a.药物与抗体直接交联b.药物通过小分子交联剂与抗体连接c.药物通过大分子载体与抗体相连2.杂交人—鼠单克隆抗体鼠源单克隆抗体临床应用中会引起人的抗鼠反应，产生人的抗鼠抗体（HAMA）,于是构建嵌合抗体。嵌合抗体(chimericantibody)从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。3.人源单克隆