第八讲皂苷分析

第八讲皂苷分析一、结构与分析■结构与分类·皂苷的含义及分布★·皂苷的分类★★★皂苷根据水解后苷元的结构类型分为两大类甾体皂苷三萜皂苷■皂甙元、糖、糖醛酸或有机酸五环三萜二、分布■甾体皂苷菝契，穿山龙，土茯苓，麦冬■三萜皂苷人参，三七，甘草，柴胡，黄芪，桔梗，地榆三、性质■性状■溶解度溶于水、醇，不溶于非极性有机溶剂■水解性较其他苷难，可酸水解或酶水解■酸碱性甾体皂甙呈中性三萜皂甙显弱酸性鉴别方法■泡沫反应中性皂甙碱性条件下的泡沫较酸性条件稳定酸性皂甙在酸碱性条件下无差异■溶血反应■沉淀反应重金属中性盐：硫酸铵、醋酸铅-----酸性皂甙碱性盐：氢氧化钡、碱式醋酸铅-----中性皂甙■显色反应硫酸、硝酸、醋酐--硫酸、醋酸--乙酰氯色谱法■TLC极性基团越多，展开剂极性越强含量测定■比色法■紫外分光光度法■薄层色谱扫描法■高效液相色谱法HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量1.药材来源：本品为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。2.主要化学成分：含皂苷、黄酮及多糖成分等。皂苷类成分包括黄芪皂苷I~VIII及大豆皂苷I;黄酮类成分有芒柄花素、毛蕊异黄酮及其苷类等。①色谱条件■岛津LC-10A高效液相色谱仪■AlltechELSD500蒸发激光散射检测器■色谱柱为大连依利特ODS柱(4.6mm×250mm)；■流动相:乙腈－水(36:64)，流速为0.8ml/min,■漂移管温度：100℃，氮气流速：2.74ml/min；■进样量20μl。②供试样品的制备■药材粉碎，过40目筛，干燥至恒重，称取约1.5g，精密称定，置索氏提取器中加甲醇80ml，回流提取5h，回收甲醇，残渣加水10ml超声溶解后，转移至分液漏斗中，以水饱和的正丁醇萃取4次，每次20ml，合并正丁醇萃取液，用氨试液（40ml浓氨水加水配成100ml）洗涤2次，每次20ml，弃去碱水层，将正丁醇层减压回收至干，用甲醇溶解并定容至5.0ml，摇匀备用。③标准曲线的制备■精密称取黄芪甲苷对照品加甲醇制成1.008mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液100,200,300,400,500,600μl，置于1ml的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。进样20μl，以进样量为横坐标，峰面积的常用对数值为纵坐标绘制标准曲线。■回归方程为：Y=1.6236X+9.9065■相关系数r=0.9997■范围2.016-12.096μg■样品测定：取不同来源的3批黄芪药材各约1.5g，精密称定，按“供试样品的制备”项下处理并测定，结果分别为0.1689%,0.1090%,0.1206%。比色法测定黄芪■取供试品及黄芪甲苷对照品溶液适量,加入新鲜配制的5%香草醛冰醋酸液-高氯酸(1∶4)1mL,85℃水浴20min,取出,冰浴5min,加入冰醋酸5mL,摇匀,放置2h,以试剂作空白,分别在400～800nm范围内测定吸收曲线。■黄芪甲苷有2个吸收峰,分别为464nm和571nm■空白试剂在460nm处有干扰,故选择571nm为测定波长。复习思考题■用比色法测定中药中总皂苷的含量实验时，如何提高测定结果的准确性？示例1：三七RadixNotoginseng（见生药学）【理化鉴定】1、泡沫：取粉末0.5g，加水5ml，温浸30分钟（或冷浸振摇１小时）,滤过。取滤液适量，置试管中，用力振摇1分钟，产生持久性泡沫。2、颜色、荧光：取本品粉末2g，加甲醇15ml，温浸30分钟（或冷浸1小时）。取滤液1ml，蒸干，加醋酐1ml与硫酸1-2滴，显黄色，渐变为红色、紫色、青色、污绿色；另取滤液数滴点于滤纸上，干后置紫外灯（365nm）下观察，显淡蓝色荧光，滴加硼酸饱和的丙酮溶液与1％枸橼酸溶液各１滴，干后，置紫外光灯下，有强烈的黄绿色荧光。3、薄层色谱：取本品粉末0.5g，加水约5滴，搅匀，再加以水饱和的正丁醇５ml，密塞，振摇约10分钟，放置2小时，离心，取上清液，加以正丁醇饱和的水3倍量，摇匀，放置使分层（必要时离心）。取正丁醇层，置蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇１ml使溶解，作为供试品液。另取人参皂苷Ｒb1Ｒg1及三七皂苷Ｒ1对照品，加甲醇制成每１ml各含2.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水（15:40:22:10）10℃以下放置的上层溶液为展开剂展开，取出晾干，喷以10％硫酸液，于105℃烘约10分钟，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，紫外灯（365nm）下，显相同的荧光斑点。【质量标准】传统认为：以身干，个大，体重，质坚实，断面灰黑色，无裂隙者为佳。2005年版药典规定：水分不得过14.0%，总灰分不得过6.0%，酸不溶性灰分不得过3.0%，醇溶性浸出物不得少于16.0%。用高效液相色谱法测定，含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rbl和三七皂苷R1三者的总量不得少于5.0％。示例2：茅莓的化学成分、有效部位提取工艺1、茅莓化学成分的分离鉴定2、制备型RP-HPLC法同时分离2个茅莓皂苷单体成分（化合物1和化合物2）3、指纹图谱研究1、茅莓化学成分的分离鉴定#蔷薇科悬钩子属植物#分布于华东和中南各省#祖国医学文献记载，具有清热凉血，活血止血等多种功能；安徽省民间用于妇科止血，疗效显著#药理实验表明，茅莓的水提取物具有止血和活血化瘀作用#化学成分报道较少，本文对茅莓的化学成分进行了系统研究，从茅莓根中分离得到6个化合物，其中化合物3、4、5和6为首次从该植物中分离得到。2、制备型RP-HPLC法同时分离2个茅莓皂苷单体成分（化合物1和化合物2）制备型高效液相色谱是于上个世纪80年代发展起来的一项新技术，为中药现代化研究提供了一个新的机遇。化合物1（suavissimosideR1）和化合物2（niga-ichigosidesF1）,以往主要采用经典的柱色谱法，操作步骤繁琐。因其结构中23位取代基分别是-COOH和-CH2OH，所以性质相近，难以用常规的分离方法得到纯度较高的标准物质。本文通过对2个（suavissimosideR1，niga-ichigosidesF1）对照品制备研究，得到一些初步经验规律，为开展茅莓相关质量研究奠定了坚实的基础2.1实验部分IndustrialScale工业制备Preparative制备Semi-Preparative半制备2.2色谱条件分析色谱柱：KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)流动相：甲醇–水(46﹕54)流速：1.0ml/min检测波长：209nm柱温：室温进样量：10μL制备色谱柱：KromasilC18(250mm×10mm，10μm)流动相：甲醇–水(40﹕60)流速：6.0ml/min检测波长：209nm柱温：室温进样量：200μL2.3单体纯度测定（归一化法）