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蛋白质表达技术DNA重组表达：在合适表达元件（如转录启动子、终止子、翻译调控序列、转录酶、翻译因子等）调控下，目的基因表达成目的蛋白质的技术。外源基因在大肠杆菌中的表达：大肠杆菌表达外源基因的优势：1、全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架2、基因克隆表达系统成熟完善3、繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定4、被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势：1、缺乏对真核生物蛋白质的复性功能2、缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统3、内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白4、细胞周质内含有种类繁多的内毒素大肠杆菌表达载体分类：按蛋白质类型分：•单纯表达:pJLA系列,用NcoI/NdeI导入AUG的载体•融合表达:融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc分泌表达:pel/ompT分泌肽按启动子分：lac及衍生的tac,trc,pac,rac等启动子IPTG诱导lamdaphagePL和PR启动子热诱导T7启动子IPTG诱导T5启动子IPTG诱导ara启动子阿拉伯糖诱导选择表达系统：1.蛋白质的大小：小的胞质蛋白和多肽最好能与运载序列连接，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达。运载序列能起到稳定靶蛋白的作用，使其免受胞内蛋白酶的降解，并能提供用于亲和纯化的配基结合位点。用蛋白酶在融合蛋白的适当位置进行切割，可以回收有活性的靶蛋白。2.蛋白质的需要量：如果需要少量的靶蛋白、酶的活性可以用粗提物来分析，一般不需要进行优化表达。3.蛋白质是否需要保留活性：（1）若只用于生产抗体，包涵体有利于分离。（2）若靶蛋白用于生物化学或细胞生物学研究，就要考虑活性，其次考虑纯化问题。（3）若要用于结构研究，最好能以可溶性状态表达。外源基因在大肠杆菌中的表达：外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：转录：启动子、终止子、核糖体结合位点翻译：密码子、质粒拷贝数启动子：Lac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统转录调控机理：具有多顺反子结构，基因排列次序为：启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）、正调节因子CAP、负调节因子lacI正调节因子CAP：cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进Plac介导的转录。基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5lacUV5突变体：PlacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。负调节因子lacI：在无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。Trp表达系统：以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统转录调控机理：色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目的基因表达Tac表达系统：tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。lac、tac启动子对宿主菌的要求：在普通大肠杆菌中，LacI阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac操纵子转录调控的需要。当多拷贝的lacO随着带有lacUV5、tac启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI阻遏蛋白与lacO的比例显著下降，无法保证每一个lacO都能获得足够的LacI阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac启动子有较高的本底转录。为了使以Lac、Tac表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI阻遏蛋白的lacI基因的突变体lacIq被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入lacIq基因以保证有较多的LacI阻遏蛋白产生。lac、tac表达系统存在的问题：IPTG用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG解决方法：lac和tac启动子的转录受温度严紧调控乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录PL和PR表达系统：以l噬菌体早期转录启动子PL、PR为核心构建的表达系统在野生型l噬菌体中，PL、PR启动子转录与否决定了l噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。转录调控的机理：由l噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL、PR启动子转录阻遏物。cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的。因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。在较低温度（30℃）时以活性形式存在在较高温度（42℃）时失活脱落宿主菌中没有cI基因产物，PL、PR启动子的高强度直接转录，带有PL或PR启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。对宿主菌的要求：用溶源化l噬菌体的大肠杆菌作PL、PR启动子表达载体的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已经溶源化cI857(ts)l噬菌体，可用作表达外源基因时的宿主菌。把cI857(ts)基因组装在表达载体上宿主菌选择范围更大PL和PR表达系统存在的问题：由于PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或PR表达系统。缺陷：在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。T7表达系统：大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。含T7噬菌体启动子的表达载体：在pET系列载体中，外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控：带有pBR322的大肠菌素E1（colE1）复制区，从而使宿主菌有氨苄青霉素或卡那霉素抗性。外源基因插入多克隆位点，置于天然T7RNA聚合酶启动子或T7lac启动子的控制之下。T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。转录调控的机理：T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。化学诱导型温度诱导型双质粒系统转录调控的机理：化学诱导型：噬菌体DE3是l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5启动子和T7RNA聚合酶基因DNA片段被插入其int基因中用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。温度诱导型：PL启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。双质粒系统：一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型T7表达系统存在的问题：T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。解决办法之一：在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因。因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。其他表达系统：营养调控型：采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因phoA启动子或甘油3’-磷酸转移系统ugp启动子构建表达载体。这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi﹥5mmol/L时抑制，Pi﹤1mmol/L时激活)，具有较高的转录水平。糖原调控型：采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统（mglBAEC)mgl启动子或沙门氏菌阿拉伯糖基因araB启动子构建表达载体。这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。其调控机理类似于Lac表达系统.pH调控型：采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因cadA启动子构建表达载体。cadA启动子受培养基中H+浓度，即pH值调控。（在pH﹥8时抑制，pH﹤6时激活，pH=6时转录活力最高）。该表达系统要求菌体发酵温度控制在27～30℃之间才能使目的基因得到稳定的表达.溶氧调控型：采用大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl启动子，硝基还原酶基因nirB启动子或透明颤菌血红蛋白基因vgb启动子构建表达载体。这些启动子中都含有对氧响应的调节因子fnr的作用位点。在富氧条件下转录被抑制，在贫氧或微氧条件下转录被激活。大肠杆菌GJ100有透明颤菌血红蛋白基因（vgb）启动子控制下的T7RNA聚合酶基因表达质粒，vgb基因的转录是受环境溶氧浓度调控的，在贫氧条件下vgb基因的启动子被激活。因此，用大肠杆菌GJ100作为宿主时，表达系统调控方式为贫氧诱导型，菌体发酵时的溶氧浓度可以通过控制搅拌转速和通气量加以调节，与其他调控模式相比更适合于产业化生产过程。生物素调控型：用大肠杆菌生物素操纵子及其调控区构建表达载体，菌体生长过程中生物素会不断消耗，当浓度到达2ng/ml以下时启动子被激活。能够在没有外界的物理，化学信号的介入条件下自动诱导表达目的基因是这类表达载体的特点，其缺陷是不容易精确控制自动诱导的时刻。终止子：强化转录终止的必要性：外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物，过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率强终止子的选择与使用：目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用核糖体结合位点：核糖体结合位点：外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌