现代生物技术概论

现代生物技术概论任课教师：高文一．绪论1.人类社会发展的主要推动力是什么？科学技术2.对人类社会发展起关键作用的科学技术有哪些？即四次技术革命第1次技术革命（18世纪中叶）以牛顿的经典力学为背景，以纺织机械的革新为起点，以蒸汽机的广泛应用为标志，实现了社会主导技术与社会技术基础的变革。第2次技术革命（19世纪70年代）以钢铁技术、内燃机技术和电力技术发展和应用为主要标志，尤其是电机的研制和电能的应用。第3次技术革命（20世纪40年代）以原子能技术、电子计算机技术和空间技术为代表的新兴技术的迅速发展掀起了第三次技术革命，而电子计算机技术的产生和发展是第三次技术革命的主要标志。第4次技术革命（20世纪70年代）主要以信息技术、生物技术、材料与纳米技术、航天技术为标志。3.生物技术：是以生命科学为基础，结合其它基础学科，采用先进的工程技术手段，按照人类的设想来改造生物体或加工生物原料，从而生产出满足人类需要的产品或达到某种目的。4.生物技术与农业4.1.植物基因工程育种①培育抗病虫作物②抗逆育种③抗除草剂育种④品质改良4.2植物细胞工程①植物次级代谢产物②快速无性繁殖③原生质体融合④花粉、花药和胚的培养⑤遗传转化中的应用⑥种质资源保存4.3生物农药4.4动物基因工程育种4.5动物繁殖新技术①人工受精及精液的冷冻保存②胚胎移植及胚胎的冷冻保存③体外胚胎生产④胚胎分割技术⑤性别控制技术4.6营养全面的动物饲料4.7动物生物反应器5.生物技术与人类健康A基因工程疫苗B疾病的诊断C生物制药6生物技术与安全性生物技术，尤其是基因工程技术的出现也引起一场不小的轰动。主要的争论焦点是对人、动物、环境的潜在危害上。对人、动物的潜在危害:A致病性，B抗药性，C食品安全性。对生态环境潜在危害：A致病性和毒性，B生存竞争力，C传播扩散能力，D遗传变异能力，E遗传转移能力。转基因作物首个转基因作物------延熟保鲜番茄于1993年在美国批准上市。转基因食品早已悄然进入我们的餐桌。转基因动物的争论热点：A将转基因动物的器官移植给人类受到伦理学上的异议。B将人类基因转入食用动物也是不合适的。C将某些宗团体禁止食用的动物转入他们通常食用的动物中，如把猪的基因转入羊，可能会触怒犹太人和穆斯林。D将动物基因转入食用植物也引起素食主义者的不满。E用含人类基因的生物体作为动物饲料。生物武器7.现代高新生物技术的诸要素：高效益、高智力、高投入;高竞争、高风险、高势能二．现代生物技术概论之植物细胞工程1.植物组织培养(planttissueculture)的概念是指在无菌条件下，把离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等材料接种在人工培养基中，使其发育成完整植株的过程。其中，离体的植物器官、组织、细胞和原生质等材料一般称为外植体(explant)。2.植物组织培养的理论基础细胞学说(celltheory)一切生物都是由细胞构成的，细胞是生物体的基本结构和功能基本单位，细胞只能由细胞分裂而来。1902年，德国著名植物生理学家G.Haberlandt提出了植物细胞完能性(celltotipotency)理论。即任何一个拥有完整细胞核的植物细胞都具有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息，在特定条件下表达可产生独立的个体。其实，细胞全能性只是一种可能，要实践它必须满足两个条件：A必须把细胞从植物体的相应部位分离出来。B必须给予它们适当的刺激，尤其是激素的作用。一般情况下，一个已经停止分化的细胞要实现其全能性，需经历脱分化和再分化两个过程。细胞分化(differentiation)是指使单个细胞形成具有不同功能的组织或者器官的过程。它是外植体经脱分化、再分化形成完整植株的基础。脱分化(dedifferentiation)，也叫去分化，已经停止分化的细胞、组织、器官在离体培养条件下，逐渐失去其原来的结构和功能而恢复其分生状态，形成无组织结构的细胞团的过程。再分化(redifferentiation)，由脱分化产生的无组织结构的细胞团在离体培养条件的剌激下重新分化成具有不同结构和功能的细胞、组织、器官的过程，即再分化。3.培养基培养基(culturemedium)是植物组织培养的物质基础。其成分是植物生长发育所必需的各种物质的来源，主要包括营养元素、植物生长调节剂、碳源、维生素、有机添加物等。3.1培养基的类型培养基的种类很多，根据其培养基成分及其浓度特点，将其大致分为四类：①含盐量较高的培养基：MS培养基、LS、BL、ER、BM培养基等。目前应用最多的培养基。②硝酸钾含量较高的培养基：B5、N6、SH培养基。其中B5适合葡萄、豆科、十字花科等培养，N6是单子叶植物花药培养的培养基。③无机盐中等含量的培养基：包括H、Nitsch、Miller培养基，适合于花药培养。④无机盐含量低的培养基：主要有White、WS培养基等，多用于生长根培养。常用培养基配方(单位：mg/L)3.2培养基的成分①大量元素，主要为培养物提供N,P,K,Ca,Mg,S,Cl等物质，它们参与植物的结构、功能、代谢以及生长发育调节等各个方面。其中的N主要有硝态氮NO-3和氨态氮NH+4的形式，并且以NO-3为主，一般使用KNO3、NH4NO3或者Ca(NO3)2。而高浓的NH+4会对培养物有毒害作用，适量的NH+4可以防止因NO-3过多所引起的培养基偏酸。培养基中的磷主要以PO3-4的形式添加，如KH2PO4或者NaH2PO4。钾与植物碳水化合物的合成、转移、运输及物质代谢有密切关系，要求浓度较高，以KCl或KNO3的形式添加。而Ca、Mg、S的浓度不宜过高。②微量元素，主要有Fe、Mn、Zn、B、Cu、Co、Mo。微量元素大多是生物酶的辅酶，对调节物质代谢十分重要。需求小，但是必需添加。其中的Fe是叶绿素形成必需的，常以FeSO4·7H2O与Na2-EDTA的螯合物形式添加，否则易出现沉淀。③有机成分糖类可作为培养基的碳源，尤其是蔗糖，其遇热易分解，有利于吸收利用，其浓度一般为2-5%。也可调节培养基的渗透压。维生素对植物生长和分化有促进作用，其用一般为0.1—1.0mg/L。包括维生素B1(盐酸硫胺素)、维生素B6(盐酸吡哆醇)、维生素B5(烟酸)、维生素C(抗坏血酸)等。肌醇，又叫环己六醇，其能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化和细胞壁的形成有作用。其使用浓度一般为50—100mg/L。氨基酸，是蛋白质的成分，可直接被植物细胞吸收利用。主要有甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。其用一般在10—1000mg/L。④植物生长调节剂生长素(auxins)，主要用于诱导愈伤组织的形成、根的分化及细胞的分裂和伸长。常用培养基中的生长素类物质有IAA、IBA、NAA、2,4-D、ABT生根粉等。细胞分裂素(cytokinins)，用于促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成。常用的细胞分裂素有6-BA、2-ip、ZT、KT等。赤霉素(gibberellins,GA)，其可加速细胞的伸长和打破休眠。常用的赤霉素是GA3。脱落酸(abscissicacid,ABA)，对体细胞胚的发生和发育有重要作用。由于ABA有促进休眠、抑制生长的作用，也常用二超低温保存中。⑤培养基的其它成分凝固剂，对培养材料起支撑固定作用。常见的凝固剂有琼脂、琼脂糖。琼脂从海藻中提取的高分子化合物，本身不提供任何营养。在95℃变为溶胶，在40℃左右开始凝固。其用量为6—10g/L。活性炭，其有抑制褐变、减轻玻璃化、促进生根的作用。用量一般为0.5—3%。抗生素，主要是防止外植体内生菌造成的污染。常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、利福平、卡那霉素、庆大霉素、头孢等。用量为5—20mg/L。抗氧化物质，用于抑制外植体的褐变。常用的抗氧化剂有半胱氨酸、维生素C、谷胱甘肽、硫脲、柠檬酸和聚乙烯吡咯烷酮等。硝酸银，其中的Ag+参与细胞膜上的乙烯受体蛋白对乙烯的竞争来抑制乙烯的活性。在培养基中加适量的AgNO3，能促进愈伤组织的发生或体细胞胚胎的发生。另外，其克服试管苗玻璃化、早衰及落叶等也有明显效果。⑥PH值，培养基的PH值一般为5.5—6.0，常用5.8。PH超过6.5，培养基过硬；低于5.0又不易凝固。一般用1mol/LNaOH或HCl进行调节。母液，一般是指培养液的浓缩液，也称贮备液。使用母液可以保证培养基各成分的准确性、配制及使用的方便性，而且便于低温保存，从而显著提高工作效率。母液一般将培养基配方扩大10倍、20倍、100倍、200倍，甚至更高倍数的浓缩液。配制母液和培养基时一般使用纯度较高的蒸馏水或去离子水。母液通常配成大量元素、微量元素、铁盐、植物生长调节物质、有机物等母液。母液一般于2--4℃的冰箱中保存。配制母液时的注意事项：A大量元素和微量元素在配制母液时各物质应分别称量、分别溶解，在充分溶解后边搅拌边混合，混合时一定按先后顺序以避免Ca2+与SO2-4,PO3-4结合发生沉淀。B铁盐要单独配制，也是分别称取FeSO4·7H2O和Na2·EDTA·2H2O，分别充分溶解，边搅拌边混合。调整PH值至5.5，定容后转入棕色瓶。C有机物母液，主要是维生素和氨基酸，也是分别称量、分别溶解、混合定容。而糖和琼脂用量较大，可随用随取。D植物生长调节剂母液，一般母液浓度为1mg/mL或者0.1mg/mL，因用量较小，可配成50mL或100mL。注意各生长调节物质应单独配制成母液。NAA、IBA、IAA等一般用少量的95%乙醇溶解，再用蒸馏水定容；2,4-D不溶于水，可用少量的0.1mol/L的NaOH溶解，再用蒸馏水定容；KT、6-BA要先用少量1mol/LHCl，TDZ用0.1mol/LNaOH溶解，ZT用少量95%乙醇溶解，GA3用少量95%乙醇溶解，ABA用少量95%乙醇或甲醇溶解，多胺易溶于水，多效唑可用少量甲醇或丙酮溶解，油菜素内酯用少量甲醇或乙醇溶解。E每种母液配制完成，不要忘记贴上标签，注明配制日期及母液类型。3.4培养基的配制及注意事项①准备好称量用的器具，如量筒、烧杯、移液管、移液器、玻璃棒、搪瓷锅、电炉或电磁炉、分装器等。按培养基配方及所要配制的数量计算好各成分的分量，取出母液并按顺序摆好。②在可加热容器内加所配培养基数量1/3体积的蒸馏水，按量加入琼脂或琼脂粉，按计算好的母液添加量分别依次加入大量元素、微量元素、铁盐、有机物、其它物质，最后加入适量蔗糖搅拌均匀。生长调节剂必须在高温高压灭菌后再加入。③加蒸馏水定容，搅拌均匀。并做好标记，以防加热时水分蒸发，造成体积减少。④调整PH值。用1mol/L的NaOH或HCl进行调节，一般为PH5.5—6.0，常用5.8。注意高温高压灭菌后，可使PH值降低0.3—0.5个单位。⑤分装。一般占培养容器的1/4—1/3。注意不要让培养基粘到培养瓶的内壁和瓶口，容易引起污染。注意：做好标记，配制日期及培养基种类。⑥封口。培养基分装好后，一般用硫酸纸、耐高温塑料盖、封口膜等立刻封口，以防污染。4.组织培养中的灭菌技术4.1环境灭菌主要包括准备室、无菌操作室（超净工作台，也称接种室）、培养室等。它们都可采用紫外杀菌、酒精擦拭的方式灭菌。如超净工作台，本身带有空气过滤系统（提前打开工作台吹风）---然后用70—75%的酒精擦拭—再打开紫外灯20—30min。注意紫外线对皮肤和眼睛有伤害。对于污染严重的封闭空间，可采用福尔马林配合高锰酸钾进行熏蒸（福尔马林2mL+高锰酸钾0.2g混合/m3）4.2培养基灭菌湿热灭菌，也称高温高压灭菌，即在密闭的高压锅内产生蒸汽，当锅内温度达到121℃，压力为0.105MPa时，保持此温此压15—20min，可很快杀死各种真菌、细菌及高度耐热的芽孢。注意事项：①灭菌锅应提前加入适量的水。②锅内待灭菌的培养基应摆放平而不能倾斜。③锅内不要装太满。④锅内的冷气必须排放出去。⑤对灭菌条件要严格控制。⑥灭菌完成后，应缓慢排气降压，等压力表指针回零，才能打开锅盖。过滤灭菌，利用孔径在0.45um