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陈金龙1、荧光基本原理荧光是发光体分子中原子的核外电子由高能级回跳到低能级所产生的辐射。某些物质吸收了与它本身的特征频率相同的光量子后，其原子中的电子被激发到较高的能级，从而产生吸收光谱。有些物质，当用紫外光线照射时，它吸收了某种波长的光后还会发射出各种颜色和不同强度的光；而当紫外线停止照射后，这种光也随之消失，这种光称为荧光。荧光是跃迁到激发态的电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态所发射的光。荧光的波长比吸收的紫外线的波长要长些。由于物质的分子结构不同，所吸收的紫外线和所发射的荧光的波长也不同。被这些物质吸收的紫外线称为激发光，产生的发射光即荧光。物质的荧光有两种：自发性荧光和诱发荧光。后者常用，能产生荧光的生物染色剂称为荧光染料或荧光探针，组织或细胞的荧光染色只有在配备了适当光源的荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下才能显示和观察。2、常见染料种类荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的物质。它们大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。荧光分子探针主要包括荧光基团、连接基团和识别基团。荧光基团是发出光学信号的信息源,识别基团是可以与待检测物特异性结合的基团,而连接基团是连接荧光基团和识别基团的部分。常规的荧光染料：1）小分子。香豆素；酞菁染料；异硫氰酸酯类（异硫氰酸酯荧光素FITC,罗丹明RhB,Rh6G）；罗丹明（RhB,Rh6G）；青色素染料。2）稀土金属复合物：Tb（绿），Eu（红）3）量子点：半导体纳米晶体（ZnS@CDSeQDs）4）金属纳米簇：Au，Ag，Pt，Cu。5）碳纳米材料：石墨烯，石墨烯量子点(GQDs)，C60，单壁碳米管（SWNTs）非常规荧光染料：多光子和上转换；聚集诱导发光效应（AIE）3、分析化学药物分子相关期刊名目TrendsinPharmacologicalSciences、NatureReviewsMolecularCellBiology、JourneyofAmericanChemicalSociety、ChemicalCommunications、Organicletters、MolecularPharmacology、medicinalresearchreviews、Biological&PharmaceuticalBulletin、TetrahedronLetters、Talanta、DrugMetabolismandDisposition、AnalyticalChemistry,TheAnalyst，JournalChromatographyA，JournalChromatographyB(荷兰)，ABC(AnalyticalandBioanalyticalChemistry),Electrophoresis,science,nature,CNKI,AnalyticaChimicaActa,JournalofSeparationScience,JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis,AnalyticalSciences,Chromatographia,AnalyticalLetter,JournalofChromatographicScience,ChineseJournalofanalyticalchemistry国内：药学学报、药物分析杂志、中国药学杂志等丁黎1、生物样本种类，特点，及前处理方法1）血液。分为血浆/血清或全血。测定血浆或血清中的药物浓度能较好的反映体内药物浓度变化。若专门测定平均分布于血细胞内外的药物浓度，则用全血。血浆采集应加入抗凝剂。离心，取上清液，血清静置，移走血饼，离心，取上清液。处理方法有沉淀蛋白法、液液萃取法、固相萃取法。2）尿样，用于药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度研究。易收集，但易受生理情况影响。方法：酸解或酶解可使药物从缀合物中游离出来。3）唾液：易收集，采集后应立即出去泡沫部分的体积，放置后易分层，离心，取上清液。4）组织：为药物的吸收、分布、代谢、排泄等体内过程提供重要信息。组织处理方法：匀浆化法，蛋白沉淀法，酸碱水解，酶水解5）头发：取样方便，无伤害，检样的掺伪可能性低，可测微量元素。头发采集后需洗涤，处理方法有提取法，有机破坏法。6）其他：乳汁，精液。2、生物样品前处理方法及特点1）有机破坏法：包括湿法破坏、干法破坏和氧瓶燃烧法，适合人发样品的破坏破坏能力强，反应激烈。2）直接沉淀法：将一定量生物样品加蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清液进样。当样品中待测物浓度较高，所用方法的特异性和灵敏度达到检测要求时可以考虑用直接沉淀法。注意沉淀剂体积、沉淀剂的选择及对药物稳定性的影响（氧化、酸不稳定）。可使接合型药物释放出来，缺点容易乳化。3）液液萃取法：取一定量生物样品加有机提取溶剂，涡旋，离心，取有机层，氮气吹干，流动相溶样进样。多数药物亲脂，在适当有机溶剂中溶解度大于水相，而血样或尿样中含有的大多数内源性杂质是强极性水溶性物质，液液萃取可除去大部分杂质，从大量样品中提取药物经浓集后用于分离。注意水相pH值，提取溶剂以及有机相和水相的体积，优点在于选择性，这依赖于有机溶剂的选择。药物能与多数内源性物质分离，缺点在于乳化现象的产生：有机溶剂易挥散、有毒性、对环保不利及不能自动化。4）固相萃取法：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附或分配或离子交换或其它亲和力作用时，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂洗出杂质，再用适当溶剂洗脱药物。注意流速、进样量、缓冲液pH及用量。SPE中萃取剂与样品有很大的接触面，因此可以再短时间内有效萃取，可采用动态柱操作，可自动化，可避免乳化，柱子可弃无污染。缺点在于价格昂贵，技术要求高，批间差异大，柱子易阻塞影响分离。5）膜萃取：将膜看成是两相间的选择性屏障，在膜两侧施加一驱动力时，药物就会从一侧（供给相）迁移到另一相（接受相）。供给相的流速对萃取效率有很大影响。不仅可以实现样品分离，由于材料众多，还有高选择性，易自动化。3、体内药分评价指标及标准1）特异性：6个不同个体的空白生物基质，必须证明所测定物质是受试药品的原型药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质或其他代谢物及其他药物不得干扰对样品的测定。2）标准曲线和定量范围：至少6个点，应使用与待测样品相同的生物基质，加权最小二乘法。注意：定量范围应查文献，结合预实验结果确定；标曲浓度点等差或等比；线性两个九，每个浓度点的理论浓度和加入浓度的差异，最低点小于20%；用于评价干扰，要随行空白；待测样品浓度超出标曲范围时，应用空白生物基质稀释后测定，不能使用标曲外推3）定量下限是标曲上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度，不是越低越好，在低浓度下可能不成线性，应能满足测定3-5个消除半衰期时样品中的药物浓度，80-120%。4）精密度与准确度。精密度每天一批，一般做3批，选择高中低三个浓度水平，每个浓度水平至少五份。准确度不单独考察，在考察精密度的同时就得到，低点80-120，中高点85-115。低浓度一般选在LLOQ3倍以内，高浓度在标曲最高点80%-90%。5）样品稳定性：室温放置（1-10h）；反复冻融，一般3次，每次至少24h12h12h；长期冰冻。6）提取回收率:应考察高中低三个浓度的提取回收率，结果应当精密和可重现。质控样品：高中低3个浓度，双质控，每批至少查5%质控样品（但至少6个质控样品）。质控样品测定结果的偏差应小于15%，低浓度点偏差应小于20%，最多允许1/3质控样品超过上限，但不允许出现在同一浓度中。4、代谢物研究的制备方法体外方法。1）肝微粒体温孵法2）肝细胞温孵法3）基因重组酶温孵法4）肝组织切片法5）离体肝灌流法6）肠道菌群体外温孵法体内方法。1）胆汁2）尿液：采集的尿是自然排尿，包括随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿及时间尿几种。3）粪便4）血液5）其他：乳汁、肝匀浆等严方1、蛋白质组学的定义定义：意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。2、蛋白组学的特点蛋白质组学研究与传统蛋白质化学研究不同。传统蛋白质的研究主要针对单个蛋白质。蛋白质组学以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。（多蛋白质系统）蛋白质组学较之前的基因组学对于生命现象的解释更直接、更准确。蛋白质对生命活动的直接作用比基因复杂得多．对于某一种生物或有机体来说，基因组是唯一的，而蛋白质组随细胞的种类、功能、生理状态、环境条件和病理状态而不断变化，因此仅仅从基因的角度来研究是不够的。蛋白质化学包括研究蛋白质的结构和功能，通常涉及物理生物化学或机械酶学，蛋白质组学的内容是系统生物学，而不是结构生物学。蛋白质化学研究工作通常包括完整序列测定、结构测定以及进行结构控制功能的模型研究；蛋白质组学需进行复杂混合物的分析，通过在数据库匹配工具下进行部分序列的测定。蛋白质组学研究的目的：确定所有的蛋白质3、蛋白组学的定量方法：1、双向凝胶电泳twodimensiondifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE是一种新出现的荧光标记的定量蛋白质组学技术。DIGE系统基于荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术，是利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向SDS-PAGE凝胶图像。利用蛋白质等电点和分子量差异，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。优点在于:重复性大大提高、蛋白质样品的差异表达更精确直观、动态范围更宽、染色时间短、荧光标记不会影响质谱分析结果。缺点是其标记方法只适用于含有赖氨酸的蛋白质;对于赖氨酸含量少的蛋白质的DIGE标记有一定的困难。因为只有一小部分蛋白质被标记,大部分蛋白质在Cy3、Cy5标记的谱图上看不到。蛋白质双向电泳的第一向是等电聚焦-----根据不同蛋白质分子所带电荷量的差异，以等电点聚焦技术进行分离（蛋白质的等电点）。该原理基于2个前提----蛋白质是两性电解质,该分离技术采用固定pH梯度技术(IPG)可以实现等电点只差0．01pH单位的蛋白质的分离；载体两性电解质所形成的连续pH梯度，每种蛋白质都迁移至与他的PI值相一致的PH处。2、Lable-free3、iTRAQ绝对定量技术4、SILAC稳定同位素代谢标记5、ICAT同位素亲和标签技术4、二维电泳：第一相：IEF固相PH梯度等电聚焦水平方向区分电荷效应；第二相SDS-PAGE电泳垂直方向区分分子量大小蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染色后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线。宋敏1、手性药物是指结构中含有手性中心（也叫不对称中心）的药物，它包括单一的立体异构体、两个以上（含两个）异构体的不等量的混合物及外消旋体。类型：1）两个对映体具有完全相同的生物活性2）两个对映体具有完全相反的生物活性3）药物的生物活性完全或主要由其中一个对映体产生4）两个对映体的生物活性不同，但合并用药有利5）一个对映体有严重的毒副作用主要任务是为药物的筛选与进一步研究提供足够数量与纯度的立体异构体。主要研究对象：单一立体异构体、两个以上（含两个）异构体的不等量的混合物绝对构型确证的常用方法：比旋度测定；手性柱色谱；核磁共振；单晶X衍射；旋光色散