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第6章植物的胚胎培养和离体授粉第1节胚胎培养对无菌分离出的成熟胚或未成熟胚进行体外培养,以获得发育正常的植株的技术.成熟胚:具有完整的胚芽、胚根、胚轴和子叶等.未成熟胚:子叶形胚前各发育期的胚.广义:胚培养还可包括胚珠和子房培养以及胚乳培养等1成熟胚培养1.1培养基成熟胚在简单的培养基上就可培养，一般由大量元素的无机盐和蔗糖组成。1.2培养方法：成熟种子表面消毒在超净台中解剖种子取出胚种植在培养基上在常规条件下培养2幼胚培养幼胚在胚珠中是异养的，因此需要通过培养基提供各类营养和生物活性物质。2.1幼胚的培养方法取材幼胚剥离接种培养2.2影响幼胚培养的因素1)胚胎的发育时期双子叶植物合子胚的发育过程:原球胚、心形胚、鱼雷胚、子叶形胚和成熟胚等4个阶段.(1）双子叶植物一般心形期以后的双子叶胚比较容易培养。胚龄越小越难培养。(2）单子叶胚一般受精后8d左右，长度在0.5mm以上的禾谷类胚在离体培养时较易成活。越小越难。采用Monnier(1976,1978)建立的双培养基培养方法可培养50~60微米长的早期球形胚.2.2培养基比成熟胚要求高.常用Nitsch,MS,1/2MS等，禾谷类还常用N6，B5等.(1)无机盐:成分较复杂，含多种微量元素。(2)碳水化合物:蔗糖是多数植物最好的碳源,也有渗透调节作用.蔗糖浓度一般高于成熟胚.(3)维生素:发育初期的幼胚必需加入某些维生素.常用:硫胺素、生物素等.(4)氨基酸：对不同植物和不同发育时期的幼胚,各种氨基酸的效果不同.(5)植物生长物质:低浓度的生长素、赤霉素或激动素对某些植物幼胚生长有益处.不同植物和不同发育阶段的幼胚要求不同。(6)天然附加物：幼胚培养基中常添加一些植物的胚乳.2.3培养条件温度：大多数植物胚胎培养的温度为25~300C,但不同植物要求不同。光照：幼胚培养初期一般在弱光或黑暗条件下培养。也因植物而异.pH：不同植物和不同时期的幼胚对pH的要求不同.气体成分(二氧化碳;氧气等):对幼胚培养也有影响。2.4培养过程：双子叶植物（球形胚晚期以及更大的荠菜胚）的培养：消过毒的荠菜蒴果放在几滴无菌培养基中用镊子将蒴果外壁的两半撑开，露出胚珠解剖镜下可见胚珠中绿色的鱼雷形或更幼龄胚由胎座上取下一个胚珠，放在凹玻片中（内有一滴培养基）用锋利的有柄刀片将胚珠纵切成两半留下有胚的一半，仔细剔除胚珠组织取出联着胚柄的完整胚(较老胚在胚珠上无胚的一侧切一小口，用钝头解剖针轻压珠被把完整的胚挤出到周围的液体中)接种到Monnier(1976)培养基上幼胚发育到鱼雷形阶段转移到降低了蔗糖浓度（2~3%）的同样培养基上发育成熟植株3植物胚胎培养的应用3.1远源杂交中克服杂种不育（胚胎拯救）挽救杂种胚以产生稀有杂种.如：普通大麦和球茎大麦；柑橘类合子胚培养等。3.2促进无生活力或生活力低下的种子萌发如:野生食用芭蕉（M.balbisiana）;早熟桃和樱桃;椰子(Makapuno)等.3.3缩短育种周期克服种子休眠；生活力快速鉴定；GA3.4单倍体的产生如大麦球茎大麦；小麦玉米：胚胎发育早期父本染色体被排除，形成单倍体胚，生长相当缓慢。必须把胚剥离出来进行培养，才能得到单倍体植株。3.5植物种质保存幼胚具备超低温保存要求细胞原生质浓、无液泡化、细胞壁较薄等有利条件,因此用幼胚进行超低温种质保存效果较好.3.6理论研究第2节胚珠和子房培养1胚珠培养(ovuleculture)包括授粉和未授粉胚珠的培养1)培养方法:授粉时间合适的子房表面消毒无菌剥出胚珠（一般带胎座）培养2)培养基应用较多的有MS、White,NitschN6等.根据胚珠发育时期的不同、是否带胎座及不同植物种类,需要加不同的植物生长物质。有的还要再加一些天然提取物.蔗糖浓度5%左右。3)影响胚珠培养的因素(1)发育时期球形胚或更后期的胚珠,较易培养；培养基较简单.(2)有机成分培养基中添加胚乳往往有利不同植物对不同种类的激素反应不同.(3)胎座组织胎座组织的存在一般对胚珠中胚的生长发育有重要作用.2子房培养包括授粉或未授粉子房的离体培养.2.1培养基MS、Nitsch、White等培养基的无机盐,加入适当的有机成分和植物生长物质.有时也可加一些复杂的天然提取物.2.2外植体受精子房：授粉后一定时间摘取花蕾,除去花萼、花冠和雄蕊,进行表面消毒，接种。未受精子房：在开花前1~5d摘取花蕾,其它同上。2.3子房培养物的细胞倍性n，2n，3n3未传粉子房和胚珠培养产生单倍体影响离体子房和胚珠产生单倍体的主要因素:3.1供体植物的基因型和子房的发育阶段不同植物及不同品系诱导产生单倍体植株的频率有明显差异选择处于合适的胚囊发育阶段的子房或胚珠3.2培养基成分需将植物生长物质调到合适浓度，使其既可诱导孤雌生殖，又不至于使体细胞增殖愈伤组织。(例：MCPA)向日葵中，不同的蔗糖浓度引起不同的反应3.3培养条件冷冻预处理或较高温度预培养光照第3节离体授粉(试管受精)在无菌条件下，培养离体的未受精雌蕊或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉管进入胚珠，完成受精过程而获得有生活力种子的技术。1离体授粉的基本技术过程1.1亲本选择1）收集花粉2）选取雌蕊或胚珠1.2离体授粉受精2影响离体授粉成功的因素2.1发育时期母本:子房或胚珠;父本:成熟花粉2.2培养基成分培养基的组成对离体授粉的成功与否、结实率的高低和籽粒的发育都有重要影响。2.3培养温度最好接近于该种植物在自然界进行受精并形成种子时的温度。2.4材料消毒2.5母体组织的保留2.6授粉方式3离体授粉技术在杂交育种上的应用3.1克服植物远源杂交不亲和性3.2克服自交不亲和性3.3诱导孤雌生殖Hess等(1974):母本：锦花沟酸浆(Mimulusluteus)雌蕊除去子房壁,暴露胚珠父本：蓝猪耳（Toreniafournieri）花粉结果：在1%的胚珠中获得锦花沟酸浆单倍体植株4操作实例4.1小麦雌蕊的离体授粉和受精(叶树茂等，1980)(1)材料的选择和培养：材料为丰产3号、昌潍15、白粒高、阿勃、蓝粒小偃等。于清晨将开花前2d的母本麦穗带有1～2片叶的茎秆取下，用70%酒精表面消毒后再用0.1%升汞浸泡3～5min，取出用无菌水冲洗3次后再用紫外光照射20min。在无菌条件下去雄并套袋，在光照条件下保持2d。花粉取自即将开花而花药尚未吐露的父本的麦穗，用紫外灯照射30min。接种时在无菌条件下将母本麦穗的每朵小花的外颖剥除只留下一片内颖，然后将雌蕊接种在培养基上。再将无菌花粉直接散落在雌蕊的柱头上。培养基为MS培养基＋5％蔗糖＋0.8％琼脂。ｐH5.8。室温培养，光照12～14h。(2)籽粒形成：雌蕊授粉后3d即能看到子房显著增大。授粉后6～10d籽粒的发育能达到正常成熟麦粒体积的1/2～2/3。20d后发育的籽粒逐渐变为黄色。在MS培养基上经35～40d发育的籽粒可以达到黄熟，最高结实率达97.5%。4.2玉米子房试管受精(邵启全等，1977；Hessetal.，1974)母本材料:京黄113、八趟白、获白、栖白自交系A619等。父本材料:chase自交系、紫胚、紫玉米等。母本材料的果穗在抽丝前进行套袋隔离，待抽丝后3～5d将果穗取下，用消毒过的剪刀将果穗上的花丝剪去，每个子房上只留0.5～1.5cm长的花丝。选择果穗中下部的子房，花丝向上接种于培养基上。花粉取自刚开花、花药外露但尚未散粉的玉米雄花穗，经紫外光照射30min花药裂开，在无菌条件下将花粉均匀地撒在花丝和子房上进行培养。培养基为RM或土豆培养基。ｐH5.6。在室温或25～30oC条件下培养。授粉后4d子房显著膨大。授粉后10d统计受精率，不同品种、不同培养基变化幅度从3%至85%。果穗中下部子房结实率达4.6%。果穗顶部的子房离体受精的结实率为0.8%。第4节胚乳培养研究胚乳组织的功能、胚乳与胚的关系、胚乳的生长发育及形态建成的潜力等；研究胚乳细胞是否同其它细胞一样具有全能性；探讨通过胚乳培养改良三倍体育种技术的可能性;利用离体胚乳和胚培养的方法，进一步的研究和逐步解决在远源杂交中,由于杂种胚乳的败育或胚同胚乳的不亲和性而育种失败的问题.研究胚乳细胞合成某些物质——如蛋白质、糖、脂肪、生物碱和甙等成分的生理生化机制,以期为人工模拟和工业化生产提供科学依据.1一般过程1.1材料的选择和外植体的分离处于生长旺盛阶段的胚乳,是培养取材的最合适时期。但许多双子叶植物的成熟胚乳细胞具有分裂的潜力.双子叶植物中,胚乳生长旺盛阶段的胚乳应具备如下特点，可参考:胚分化已完成，(核型的)胚乳已形成细胞组织.且充分生长,几乎达到成熟时的大小,外观为半透明的固体,且富有弹性.禾谷类成熟的胚乳不适于培养，只有较幼嫩的胚乳才能增殖愈伤组织。几种单子叶植物胚乳合适的取材时期:植物传粉后天数水稻4~7玉米8~11小麦8~11大麦8要严格区分胚乳和其它组织.接种时要小心地割去胚乳四周的组织和分离除去幼胚。1.2愈伤组织的诱导除少数寄生植物可直接由胚乳外植体产生器官或胚状体以外,绝大多数被子植物的胚乳,无论是幼嫩的还是成熟的,均需通过愈伤组织阶段.1)培养基基本培养基：MS,White,LS和MT等多种.植物生长物质:类别、浓度、比例差别很大。一些植物的提取液对培养胚乳有促进作用.PH也因物种不同而异。2）培养条件：胚乳愈伤组织生长的最适温度多在25oC左右。对光照的要求因植物不同而异。3）愈伤组织诱导过程：胚乳外植体接种6~10天后外观膨大而光滑,同时,表面或切口附近形成乳白色的隆突,且不断增多.愈伤组织.转入新的培养基诱导分化4）胚乳愈伤组织的细胞染色体检查方法:生长旺盛的新鲜愈伤组织块0.2~0.5%秋水仙碱或对二氯代苯饱和水溶液浸泡处理4~8小时流水冲洗5~10分钟,卡诺氏液或FAA固定,醋酸洋红、改良卡宝品红或孚尔根液染色压片镜检.1.3诱导分化器官和植株1)愈伤组织的选择应长势良好.通常是在继代繁殖的愈伤组织块上新增殖的愈伤组织块.2)分化苗芽的培养基胚乳植株可来源于苗芽和胚状体两条途径。需调整生长调节物质的种类、浓度、比例。接种方式对于某些芽的分化和分布有影响。3)诱导胚乳芽生根一些植物的胚乳植株可直接由胚状体或芽形成；有的则需诱导芽生根.柑橘和檀香的胚乳培养中，三倍体植株通过体细胞胚发生起源。例：柑橘属植物培养：王大元等（1978）培养基：MS+2,4-D2mg/L+6-BA5mg/L+CH1000mg/L外植体：幼龄胚乳愈伤组织继代培养：愈伤组织MS+1mg/L的GA3少量胚发育到球形期止培养基盐浓度加倍，GA3浓度提高到15mg/L胚状体小植株。1.4胚乳植株染色体数目检查植物体内的和培养的胚乳细胞中常出现高度的多倍化和各种不规则的有丝分裂现象。方法：取植株根尖或幼叶,用检查愈伤组织细胞倍性的方法处理、固定.用1NHCl在600C下水解8~10分钟(也可用酶解法);染色、压片镜检和计数.2操作实例：大麦的胚乳培养1)材料：普通大麦早熟品种开花后4~5d和7~12d的幼穗消毒解剖镜下小心剥去外部组织和幼胚胚乳接种2)培养基和培养条件：(1)MS+2,4-D1mg/L+CH500mg/L;(2)MS+NAA0.2mg/L+CH500mg/L;(3)MS+NAA0.2mg/L+KT0.5mg/L.都加入6%的蔗糖,0.8%琼脂,pH5.6,高压灭菌.日温280C,夜温160C左右,白天光强约2000lx.3)愈伤组织的形成和植株的分化受精后4~5d的胚乳,在上述三种培养基上均未形成愈伤组织;10~12d的在(1)号培养基上形成了愈伤组织,而在(2)号和(3)号培养基上同样没有反应.将(1)号培养基上的愈伤组织转移到(3)号培养基上,部分(约10%)愈伤组织块转绿,同时分化出具根、茎、叶的完整植株.不过植株中有绿的、白的及两色镶嵌的。4)植株倍性检查用前述方法,对部分胚乳植株的根尖进行染色体镜检.结果表明,除少数3n细胞外,多数为7、14和28等整倍性和非整