生化,分子,细胞试验汇总

主要培养基的配制LB液体培养基胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，用1mol/LHCl调节pH至7.4，121℃高压灭菌20min。如果需要加抗生素，则待灭过菌的培养基温度降到55℃以下后加入适量的抗生素储存液。LB固体培养基在LB液体培养基中加入2%琼脂。DMEM细胞培养基DMEM溶液90%(v/v)，FBS10%(v/v)，青霉素100U/ml，链霉素100g/mlMcCoy’s5A细胞培养基McCoy’s5A溶液90%(v/v)，FBS10%(v/v),青霉素100U/ml，链霉素100g/ml实验试剂及药品的配制1mol/LTris-HCl(pH8.0)在800ml的双蒸水中溶解Tris(三羟甲基氨基甲烷)121.1g，用浓盐酸调pH至8.0，用双蒸水定容至1000ml。121℃高压灭菌15min，备用。TE缓冲液(pH8.0)1mol/LTris-HCl(pH8.0)10ml和500mmol/LEDTA(pH8.0)溶液2ml，用双蒸水定容至1000ml。121℃高压灭菌15min，备用。500mmol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)在800mL的双蒸水中加入18.6g乙二铵四乙酸二钠，充分溶解后，用10mol/LNaOH溶液调pH至8.0，用双蒸水定容到1000ml。121℃高压灭菌15min，备用。溴化乙锭(EB)1gEB，加入100ml灭菌双蒸水中，磁力搅拌数h以确保其完全溶解，然后转入棕色瓶中，4℃保存。TAE电泳缓冲液(50×)242gTris碱，57ml冰乙酸，100ml0.5MEDTA，加灭菌去离子水定容至1000ml，使用时稀释50倍。10%SDS将10g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约80ml的ddH2O，68℃加热溶解，滴加盐酸调节pH值至7.2，定容至100ml后，室温保存。G418(Neomycin)用PBS(pH7.4)配成浓度为50mg/ml的原液，0.22m滤膜过滤除菌，分装储于-20℃备用。基因组DNA提取液1mmol/LTris-HCl(pH8.0)1mL和0.1mol/LEDTA(pH8.0)溶液20ml，0.5%(m/v)SDS，加灭菌去离子水定容至100ml，备用。蛋白提取液1MTris-HCl(pH7.6)5ml，5MNaCl3ml，10%SDS1ml，100%NP-401ml，加灭菌去离子水定容至100ml，备用。100mM姜黄素用DMSO配成浓度为100mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。100mMCPT-11CPT-11原装瓶为50mg，加入802lDMSO溶解，分装储存于-20℃备用。100mMDHADHA原装瓶为50mg，加入1758lDMSO溶解，配成浓度为100mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。100mM5-Fu用DMSO配成浓度为100mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。实验方法细胞冻存（HEK293细胞为例）1.消化细胞并700rpm离心5min收集细胞；2.吸除上清，沉淀用冻存培养基（80%DMEM，10%FBS，10%DMSO，现配现用）充分重悬；3.将细胞悬液分装至冻存管中，1ml/管，标注细胞名称/型号、代数、日期、操作者，并迅速放于室温的冻存盒内；4.-80℃过夜，然后转移至液氮罐中冻存。细胞复苏（HEK293细胞为例）1.将冻存的细胞迅速从液氮罐中取出，放入37℃水浴中进行溶解至无冰晶；2.将细胞悬液转移至15ml无菌离心管中。逐滴加入5ml完全培养基，边滴加边充分摇动；3.700rpm离心5min收集细胞；4.吸除上清以2ml完全培养基来重悬细胞沉淀并转移到6孔板中进行培养。总RNA提取1)弃12或6孔板中的原Medium后，PBS500ul/孔洗两次.2)TRIzol1ml/孔（组织经匀浆处理后每100mg加入1ml的Trizol）。吹打混匀后转移到相应的做好标签的好的1.5ml的离心管中，并立即放在冰上以防RNA降解，5min.3)氯仿200ul/管，剧烈震荡15s（Don’tVortex！），使细胞充分裂解,室温静止3min.4)4℃，12000rcf，15min.5)转移500ul上清到相应的做好标记的1.5ml的离心管中，加入500ul/管异丙醇，颠倒混匀，室温静止10min。4℃，12000rcf，15min.6)弃上清，加入用DEPC水配好的75%的乙醇1ml/管，颠倒两次后，放4℃离心机，7500rcf，5min.7)弃上清，等RNA干燥透明后加入30ul的DEPC水，吹打混匀使得RNA溶解后，1%凝胶电泳分析（100V15-20min），置于-80℃冰箱保存。基因克隆1.查找目标基因的基本信息，查找相关文献，设计克隆基因方案。利用DNA处理软件和引物设计软件设计引物，将引物序列送公司合成，根据合成引物的退火温度确定PCR退火温度。2.查询该基因有表达的细胞株，培养细胞，采用Trizol法提取总RNA。3.反转录。4.PCR：首先进行预实验，跑胶初步判断大小，摸索最佳退火温度和体系。然后进行回收目标片段。5.连接18Tvector：载体和插入片段的比例为1:3。6.转化感受态细胞，筛选单克隆。7.挑取单克隆至1mlLB液体培养基（含抗生素）中，37℃，300rpm，约10~12h，小抽并且进行酶切验证。8.测序：挑取酶切验证正确的阳性克隆送测序。9.根据测序结果，将测序正确的片段连接入真核表达载体。实验室有多种表达载体，根据需要选择。连接体系参考T4Ligase说明书。10.连接产物转化感受态，挑选阳性克隆进一步酶切验证，挑取阳性克隆中抽质粒并纯化，瞬转真核细胞（根据课题的方向选择细胞株），WesternBlot验证所构建的表达载体是否在该细胞株中表达。11.大抽，操作步骤详见说明书。中抽质粒（基因克隆时酶切验证时所用方法）1）6000rpm，离心5min（4℃），弃上清;2）重复步骤1），收集3~4ml菌液至1个EP管中；3）加入2.5ml预冷的solutionⅠ，吹打混匀，充分悬浮细菌；4）加入2.5ml现配的solutionⅡ，轻柔颠倒几次，充分混匀（solutionⅡ配置：0.4MNaOH：2%SDS=1：1）；5）加入3.5ml预冷的solutionⅢ，轻柔颠倒几次，充分混匀，中和裂解液的碱性；6）冰浴10min，使杂质充分沉淀；7）12,000rpm离心10min（4℃），轻轻吸取上清800μl/管，转移至干净的1.5ml离心管中；8）加入2/3体积的异丙醇（530μl），混匀后冰浴5min；9）12,000rpm离心10min，弃上清；10）预冷的70%乙醇溶液750μl/管洗涤DNA沉淀，12,000rpm离心10min（4℃）；11）弃上清，晾干，每管加入30μlTE(含20μlg/mlRNase)，65℃，5min；去除RNA；12）将几管合并至一管，加等体积酚、氯仿混合液(成品)，剧烈振荡10s；13）12,000rpm离心10min，取上清；14）加入1/10体积的3MNaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，即1ml；15）12,000rpm离心10min，弃上清；16）70%乙醇水溶液洗涤DNA沉淀，12,000rpm离心10min，弃上清；17）用适量ddH2O或者TE溶解DNA沉淀，得比较纯净的DNA，测浓度。琼脂糖凝胶电泳1)配制足量的电泳缓冲液（1xTAE或0.5xTBE）用以灌满电泳槽或配制凝胶；2)根据欲分离DNA片段的大小用电泳缓冲液配适宜浓度的琼脂糖溶液：准确称量琼脂糖干粉加到盛好电泳缓冲液的玻璃瓶中；3)玻璃瓶松松盖住，沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖溶化；4)用隔离手套转移玻璃瓶到55℃箱内后，待溶化的凝胶稍冷却后加入EB，终浓度为0.5ug/ml,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液；5)琼脂糖冷却时，用一合适的梳子形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5-1.0mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔；6)浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具；7)让胶完全凝结，室温下30-45min,小心拔出梳子，将凝胶安放到电泳槽中；8)向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶1mm；9)混合DNA样品和0.2倍体积的6xloadingbuffer,用微量移液器将样品混合液缓慢加至加样孔中；10)1关上电泳槽盖子，接好电极插头，设好电压和时间，按Run键，DNA应向阳极移动；11)当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔下插头和打开电泳槽盖，取出胶放入凝胶成像仪中拍照。RT-PCR1)根据所测的RNA的浓度，计算上样500ng的RNA样品所需的体积，用DEPC水补至5ul，加入1ul的6xloadingbuffer进行电泳：120V、15min。2)根据所测的RNA的浓度，计算上样2ugRNA样品所需的体积，用DEPC水补至5ul随机引物1uldNTP4ulRNA5ul65℃5min5xbuffer4ulInhibitor0.5ulRTase1ulDEPC水4.5ul30℃10min42℃50min70℃15min4℃foreverPCR产物胶回收1)按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书步骤，制备含大加样孔的1%琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物加入加样孔。2)电泳结束后，在320nm波长紫外灯下根据Marker指示快速切取目的片段，用纸巾转移至Ep管，秤取其重量。3)加入相应体积的溶胶液BufferDE-A，水浴锅75℃加热至凝胶完全融化（约6-8min）。4)加入BufferDE-B，混合均匀。5)将上步骤的所得液体加入DNA制备管中12,000×g离心1min，弃滤液。6)加入500ulBufferW1，12,000×g离心30s，弃滤液。7)加700ulBufferW2，12,000×g离心30s，弃滤液。8)以同样的方法再用700ulBufferW2洗涤一次，12,000×g离心1min。9)将制备管置于洁净的1.5ml离心管，在制备膜中央加25-30ulEluentBuffer，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。感受态细胞的制备1.准备LB培养基和LB平板。2.取冻存的Ecoli,37℃融解后接种于LB平板上，37℃培养16-20h。3.在平板上挑取单菌落（2-3mm）,转到含有100mlLB培养基的1L的烧瓶中，37℃剧烈振荡培养（250-300r/min）3h。4.去1.5mlEp管，加入1mlLB培养基，再加入200ul菌液，37℃振荡孵育过夜（300rpm/min）。5.在无菌的500ml烧瓶中加入50mlLB培养基，加入0.5-1ml培养过夜的的菌液（即稀释50-100倍），然后与37℃300r/min振荡孵育OD600=0.6(0.4-0.6)(约2h)。6.当菌液密度达到0.6以后，将菌液在冰上放30min.。7.将菌液在转入50ml离心管，4℃2500rpm,离心20min,弃上清。8.将沉淀用25ml预冷的0.1MCacl2重悬，按步骤7重复一次，弃去Cacl2溶液。9.用2ml预冷的0.1MCacl2重悬沉淀（轻柔），然后在冰上放置1h.。10.在重悬的菌液中加入丙三醇（甘油）（15%v/v）(即857ul50%灭菌甘油)，充分混匀后分装，200ul或100ul每管（1.5mlEp管），-80℃保存。感受态细菌的转化1)-80℃中取出已制备好的感受态菌，冰上放约20min。2)去1ul质粒加入1个感受态管中，混匀，放冰上约30min。3)将混合液放入已加温至42℃的循环水浴中，90s（其间，不要摇动管子）4)快速转到冰浴中，3min。5)加800ul不含任何抗生素的培养基于每管，37℃，120r/min，摇1h。6)取100ul菌涂板于含有相应抗生素的LB培养板上，37℃培养箱中倒置平板培养12-14h，出现菌落。SDS碱裂解法制备质粒DNA（小抽）1)取1mlLB培养液加入1个1.5ml的EP管中，挑一个单菌落于该管中，37℃，300r/m