生化-第10章DNA生物合成

DNA的生物合成主要内容•中心法则•DNA的复制•DNA的半保留复制•参与复制的酶类•复制过程•DNA的损伤与修复•DNA损伤•DNA损伤的修复•逆转录DNA是生物遗传信息的载体1869年，Johann.F.Miescher首次从从莱茵河鳟鱼细胞核中发现DNA肺炎双球菌转化实验：1928年，FrederickGriffth实验J.F.MiescherF.Griffth1928,Griffth肺炎双球菌转化实验DNA是遗传信息载体的证明肺炎双球菌转化实验1944年，OswaldAvery,ColinMacLeod,MaclynMcCarty证明DNA为生物遗传信息的载体OswaldAveryColinMacLeodMaclynMcCarty1944年，肺炎双球菌转化实验DNA双螺旋结构的发现Watson&CrickNature171,737-738(1953)中心法则：解释遗传信息在生物大分子之间传递顺序的框架中心法则朊病毒DNA复制RNA复制DNA的生物合成1.DNA复制（replication）2.DNA修复（repair）3.逆转录（reversetranscription）DNA复制以母链DNA为模板合成子链DNA的过程，使亲代的遗传信息得以准确传递到子代。DNA复制机制的实验验证•半保留模型（Semiconservetivemodel）•全保留复制模型(Conservetivemodel)•分散模型(Dispersivemodel)DNA复制方式的三种假说(半保留复制)(全保留复制)(混合式)DNA的半保留复制半保留复制（semi-conservativereplication）即子代DNA双链分子中，一股链来自亲代模板，一股链为新合成的。半保留复制的意义：保证亲代的遗传信息准确传递给子代，体现了遗传的高度保真性。原核生物：Meselson-Stahl实验FranklinStahl半保留复制的实验证明原核生物复制的起点和方向E.coli，固定起始点、双向对称复制。T7，一端的17％处开始，向两端延伸。枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组时进行双向复制。质粒ColE1有固定起始点，但却为单向复制。mtDNA进行D环复制（displacedloop）。真核有多个复制起点，双向等速复制。D环复制DNA的半不连续复制复制时DNA链延伸可能有三种方式123DNA复制的半不连续性①一条链连续合成，称前导链(LeadingStrand),另一条链分段合成，称滞后链(LaggingStrand)。②原因：DNA双螺旋分子两条链方向相反，新链合成的方向只能5’→3’一个方向合成。1967年，冈崎实验脉冲标记和脉冲追踪冈崎令治1978年，Olivera实验①细胞内存在dTTP和dUTP，而DNA聚合酶Ⅲ不能区分它们。②dUTPase酶，使dUTP变成dUMP，其不能作为DNA合成的底物。③尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），切断混入尿苷的糖苷键，形成AP位点。④AP内切酶，在AP位点切出一个缺口，进行切除修复。BaldomeroM.Olivera参与DNA复制的酶类及蛋白质因子1.DNA聚合酶（DNApolymerase）2.双链DNA解链、解旋酶3.引物酶4.连接酶DNA聚合酶(DNApolymerase)•1957年，由ArthurKornberg,WashingtonUniversityatSt.Louis,从大肠杆菌(E.coli)中发现。•1959，获得NobelPrizeinPhysiologyorMedicine.•依赖DNA的DNA聚合酶(DNAdependentDNApolymerase)原核生物复制的酶系统DNA聚合酶的共同特点：(1)需要提供合成模板(2)不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH(3)合成的方向都是5’→3’(4)除聚合酶功能外，还有其他功能，如3’-5’,5’-3’外切酶功能。大肠杆菌中的三种DNA多聚酶DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ不同种类亚基数目1≥7≥10相对分子质量103000880009000005´→3´核酸聚合酶活性+++3´→5´核酸外切酶活性+++5´→3´核酸外切酶活性+--聚合速度（核苷酸/分）1000~1200240015000~60000持续合成能力3~2001500≥500000分子数/细胞40010010~20功能切除引物，修复修复复制DNA聚合酶I的结构与功能DNA聚合酶I有6个结合位点：(1)模板结合位点；(2)引物结合位点；(3)引物3‘－OH结合位点；(4)底物dNTP结合位点；(5)5‘→3’外切酶结合位点；(6)3'→5'校正位点。DNA聚合酶Ⅰ的功能1.5’→3’聚合功能2.3’→5’外切活性3.5’→3’外切活性(1)切口平移（nicktranslation）(2)链的置换(3)模板转换（template-switching）4.内切酶活性原核生物复制的酶系统DNA聚合酶I功能切口平移(nicktranslation)原核细胞的DNA聚合酶聚合酶II活性弱,作用不详有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性有从3’——5’外切酶的活性DNA聚合酶Ⅲ的结构与功能DNA聚合酶III的结构连接酶（ligase）•将不连续的DNA片段的5’-PO4与相邻的3’-OH以3’-5’磷酸二酯键连接起来。•原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATP。单链结合蛋白（singlestrandbindingprotein）•负责与DNA单链区域结合•防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA•防止新形成的单链DNA被核酸酶降解•E.coli为四聚体，177aa双链DNA解链、解旋酶•解旋酶(helicase):把DNA双链的氢键打开，催化双螺旋解链需消耗ATP双链DNA解链、解旋酶拓扑异构酶（topoisomerase）I型，切断DNA单链;II型，切断DNA双链。需消耗ATP。兼有内切酶和连接酶活性,可迅速使DNA两条链断开又接上,消除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量,同复制有关。引物酶（primase）依赖DNA的RNA聚合酶，但不同于转录的RNA聚合酶，以复制起点的DNA序列为模板，合成5’-3’的RNA短片段复制起始区的结构特点1.富含A－T，双链易于解开，起始复制；2.含有多个回文结构(9－14个GATC),8个GATC较保守,CATC中的“A”已甲基化;3.具有4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；4.此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子，其可能的作用是：①转录产生引物；②产生复制必要的蛋白；③产生调节功能的RNA；④起转录激活作用。原核生物DNA复制过程复制的起始原核生物只有一个起始点（origin,ori）真核生物有多个起始点。1.DNA解为单链解旋酶：进行解链，形成超螺旋。拓扑异构酶：超螺旋的转型，把正超螺旋转变为利于复制的负超螺旋，形成复制叉（replicationfork）。原核生物DNA复制过程2.引物合成：促进引物合成的蛋白质因子与复制起始点(ori)结合，形成引发体前体（preprimosome）。引物酶与引发体前体结合，形成引发体（primosome），合成与模板DNA链3’端互补的RNA引物。原核生物DNA复制过程3.复制的延长由DNA聚合酶III催化，是主要的复制酶。前导链（leadingchain）：模板DNA链为3’—5’方向，新链按5’—3’方向连续合成，合成方向与解链方向一致。滞后链（laggingchain）：模板DNA链为5’—3’方向，合成方向与解链方向相反，不能连续合成新链。DNA复制是半不连续的过程。原核生物DNA复制过程4.复制的终止:由DNA聚合酶I和DNA连接酶催化完成。DNA聚合酶I切除引物，并且填补空隙DNA连接酶把DNA片段连接起来。真核生物的五种DNA聚合酶αβγδε酶活性5′→3′聚合酶+++++3′→5′外切核酸酶-++++5′→3′外切核酸酶---++构成（亚基）44425分子量（kD）30036～38160～300170250细胞内定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核主要功能引发修复复制复制修复真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶α，负责新链的起始合成DNA聚合酶δ，负责前导链的延伸聚合酶ε，可能负责滞后链的延伸，也可能有其他功能DNA聚合酶γ，负责线粒体DNA的复制DNA聚合酶β，修复功能真核生物复制的特点：1.复制起始点多2.引物RNA短3.冈崎片段短4.DNA聚合酶不同5.连接酶作用时需要ATP提供AMPDNA的损伤与修复DNA损伤多数是自发性突变，是遗传进化的基础。环境的理化因素诱导，如紫外线、化学诱导剂如亚硝酸盐等。UV，胸腺嘧啶二聚体DNA损伤类型1.点突变（碱基错配）DNA聚合酶复制错误产生DNA损伤类型2.碱基的缺失或插入。DNA损伤类型3.DNA分子断裂DNA单链断裂DNA双链断裂放射线，重金属，病毒整合，DNA重排DNA损伤的修复光修复：通过光复活酶,修复嘧啶二聚体，广泛存在在于生物界,但人类缺乏。切除修复：依靠特异内切核酸酶，识别损伤结构，并进行修复、合成和连接。重组修复:依靠重组蛋白A,先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口SOS修复:DNA损伤广泛，难以继续复制时的一种应急修复。包括切除修复和重组修复，有多种酶和蛋白参与。特点：快而粗糙，错误率高，故而突变率高。逆转录作用中心法则的重要补充逆转录和逆转录酶的发现实验现象：1.1964年，Temin等首次发现：DNA合成抑制剂可以遏制鸟类肉瘤病毒(ASV)等RNA肿瘤病毒所造成的感染表明在RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中需要合成DNA。2.ASV子代病毒颗粒的产生被放线菌素D所抑制说明转录对于RNA肿瘤病毒增殖可能是必须的。假说•DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌过程中的中间物•这一过程大致为：RNA肿瘤病毒－DNA原病毒（或前病毒）－RNA肿瘤病毒。•1970年，Temin和Baltimore分别在RNA肿瘤病毒中发现了逆转录酶（reversetranscriptase）HowardTeminDavidBaltimore逆转录的证明逆转录病毒（retrovirus）1.定义：含逆转录酶的RNA病毒称为逆转录病毒。所有的RNA肿瘤病毒都是逆转录病毒，但是，并不是所有的逆转录病毒都致癌。2.逆转录病毒的基因组：逆转录病毒基因组由两条相同的正链RNA分子组成，其5‘端有cap，3’端有ployA尾。逆转录酶（reversetranscriptase）定义：是RNA指导的DNA聚合酶。具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶、DNA指导的DNA聚合酶和RNaseH的活性。合成DNA的方向：逆转录酶合成DNA的方向为5’－3’。合成DNA的引物：不能从头合成DNA。引物为逆转录病毒包装时从宿主细胞获得的tRNA分子。一些鸟类逆转录病毒以宿主tRNATrp（色氨酸）为引物，鼠类逆转病毒则以宿主细胞tRNAPro（脯氨酸）为引物。RNaseH活性：是指逆转录酶可以从5’－3’和3’－5’两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。逆转录逆转录（reversetranscription）：是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。逆转录是对中心法则的重要修正和补充！RNA同样具有遗传信息的存储、传递和表达功能逆转录作用图逆转录原理的应用－RT-PCR反转录PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）：是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR过程•首先经反转录酶，以RNA为模板逆转录合成cDNA。•然后以cDNA为模板，PCR扩增合成目的基因片段。RT-PCR的用途1.检测细胞中基因表达