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生化分析AnalyticalBiochemistry定义Laboratorymethodstodeterminethecompositionofbiologicalsamples.生命活性物质的分析和利用生物化学技术所进行的分析.主讲内容免疫分析(3)氨基酸分析(1)蛋白质分析(2)酶法分析(2)糖的分析(1)核酸分析(3)生物大分子分离纯化技术(2)参考书目:生化分析,李元宗,常文保,高等教育出社,2003.AnalyticalBiochemistry,D.J.Holme,H.peck,世界图书出版公司,1999.免疫分析利用抗原抗体之间特异性反应实现对抗体、抗原或相关物质进行检测的分析方法．历史:JennerBehring,北里(1890)Yallow,Berson(1959)一、基本概念１、抗原（Antigen,Ag)能引起动物机体特异性免疫应答，并能和抗体发生特异性结合反应的物质。免疫原性(Immunogenicity):引起免疫应答的性质。抗原性(Antigenicity):与抗体反应的性质。半抗原(Hapten)：不能引起免疫应答，却能和抗体反应的一类小分子。抗原决定簇(AntigenDeterminant):决定或控制抗原特异性的特殊化学基团。免疫原性的化学基础２、抗体通过免疫应答产生的，能够与抗原发生特异性反应的蛋白质就是抗体。a:抗体的结构b:免疫球蛋白的种类c:免疫球蛋白的抗原决定簇d:抗体的制备e:单克隆抗体a:抗体的结构(1)a:抗体的结构(2)a:抗体的结构(3)抗原结合段(FragmentAntigenBinding,Fab)结晶段(FragmentCrystalization,Fc)F(ab’)2b:免疫球蛋白的种类IgG、IgA、IgM、IgD、IgE重链类型:γ、α、μ、δ、ε轻链类型:κ、λ免疫球蛋白的种类(2)c:免疫球蛋白的抗原决定簇免疫球蛋白本身是良好的抗原,其分子之间的结构差异表现为抗原性的不同,表现在各免疫球蛋白分子的抗原决定簇中氨基酸的组成和序列的不同.血清学上据此将免疫球蛋白分子的抗原决定簇分为以下三种类型:同种同型(Isotype):同一种属所有个体共同具有的免疫球蛋白分子抗原特异性.同种异型(Allotype):同一物种不同个体间免疫球蛋白具有不同的抗原特异性.独特型(Idiotype):不同个体的每一抗体产生克隆,针对不同抗原时,产生的不同特异性抗体的高变区之氨基酸种类和排列各异,因此表现出各自独特的抗原特异性.d:抗体的制备(1)(1)、抗原的制备（半抗原与载体蛋白的偶联）：重氮盐偶联法、碳二亚胺法、戊二醛法、混合酸酐法重氮盐偶联法碳二亚胺法戊二醛法混合酸酐法d:抗体的制备(2)(2)、影响免疫应答的因素:遗传因素、抗原给予方式、佐剂的影响d:抗体的制备(3)(3)、抗体产生的细胞理论d:抗体的制备(4)(4)、抗体产生的动力学d:单克隆抗体次黄嘌呤(Hypoxanthine)氨基碟呤(Aminopterin)胸腺嘧啶(Thymidine)次黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶核苷激酶(TK)二、免疫分析方法1、分析方法基础：抗原抗体反应2、基于免疫沉淀反应的经典方法3、标记免疫分析方法１、分析方法基础：抗原抗体反应a、结合力：离子键（静电）疏水力范德华力氢键b、价态：可以与一个抗体分子反应的抗原的数目c、特点：高度特异性可逆性２、基于免疫沉淀反应的经典方法凝聚反应（AgglutinationReaction)颗粒性抗原（细菌血球等）与相应抗体在适当条件下相互作用，经过一定时间出现肉眼可见的凝聚现象．直接凝集反应:颗粒性抗原与相应抗体直接作用.间接凝集反应:可溶性抗原或抗体与无关载体(颗粒)结合后再与相应抗体作用出现凝集.沉淀反应（PrecipitationReaction)可溶性抗原与相应抗体在适当条件下反应，经过一定时间出现可见的沉淀现象．沉淀反应（PrecipitationReaction)凝胶沉淀反应(免疫扩散)单向琼脂扩散实验(SimpleDiffusionTest):定量检测各种免疫球蛋白及亚类及其它血清蛋白双向扩散实验(DoubleDiffusionTest):复杂抗原成分的精细分析及抗原抗体纯度测量双向扩散实验(DoubleDiffusionTest):A:同一性反应B:非同一性反应C:部分同一性反应免疫电泳免疫电泳Immunoelectrophoresis抗原样品在凝胶中电泳分离后,在抗原谱带旁开槽加入抗体进行双向扩散,在适当处出现沉淀线.常用于鉴定提出物纯度对流免疫电泳CounterImmunoelectrophoresis电泳缓冲液的pH值界于抗原抗体pI之间,抗原抗体在电场作用下向相反方向泳动,两者相遇于合适比例处形成沉淀线.灵敏度比双向扩散提高3-4倍.火箭电泳RocketImmunoelectrophoresis在单向扩散的基础上进行电泳的方法.实验快速.火箭电泳RocketImmunoelectrophoresis3、标记免疫分析方法均相免疫分析(HomogeneousImmunoassay):不需要结合与游离相的分离异(多)相免疫分析(HeterogeneousImmunoassay):需要固—液两相的分离非竞争性免疫分析(Non-competitiveImmunoassay)竞争性免疫分析(CompetitiveImmunoassay)均相免疫分析(HomogeneousImmunoassay):异(多)相免疫分析(HeterogeneousImmunoassay):固相载体:微粒固定相:非磁性(乳胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶)及磁性两类固体表面固定相涂覆试管微孔板非竞争性免疫分析(Non-competitiveImmunoassay)竞争性免疫分析(CompetitiveImmunoassay)竞争性免疫分析分析条件的优化(1)经验性方法a)确定标记抗原的浓度:[Ag*]=1/5[Ag]~2[Ag]b)抗体稀释曲线c)工作曲线竞争性免疫分析分析条件的优化(2)求最高灵敏度的优化法(1)求最高灵敏度的优化法(2)主要的标记免疫分析方法酶免疫分析方法（１）酶标试剂酶的选择碱性磷酸酯酶、过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、尿素酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、溶菌酶、马来酸脱氢酶酶的标记酶标记反应要尽可能小地影响酶和免疫反应的活性；酶与连接物之间的化学键在EIA条件下稳定；酶的标记率要低，高的标记率会影响EIA的灵敏度；自由态酶及被标记物应尽可能完全地与结合物分离；抗原与抗体上所标记的酶数目要一致，且能控制．酶免疫分析方法（２）固定相的选择对免疫反应试剂具有高的重现性和容量抗原与抗体间的反应速度快容易使用解离小可固定化多种不同类型的免疫反应试剂酶免疫分析方法（２）影响酶免疫分析的因素影响免疫反应的因素：PBS缓冲液、时间、温度影响酶分析的因素：底物的选择，例如,硝基苯磷酸酯（ALP,NaOH,405nm)，邻苯二胺（OPD)(过氧化物酶，硫酸，492nm）抗体的影响:抗体亲和性高，分析灵敏度高桥基的影响：酶标记抗原与产生抗血清的免疫原在结构上比较接近，因而产生对桥基的识别．(半抗原)酶免疫分析方法实例EnzymeLinkedImmunosorbentAssay(ELISA)分析人血清中HbsAg：酶标板中每孔加200uL鼠抗人乙肝表面抗原单克隆抗体溶液，置冰箱中（４℃）过夜．用PBS-Tween20缓冲溶液洗３次（每次３分钟）每孔加样品100μL，并设阴阳空白对照孔．每孔加入酶标抗体50μL，置振荡器上振荡１min,37℃温育60min,弃去孔内液体，洗涤液（含0.05%Tween-20的PBS）注满每孔，静置3min，甩干，重复４次．每孔加入底物溶液(OPD/TMB,H2O2)100μL,振荡混匀，37℃反应15min.每孔加入50ul硫酸溶液终止反应；光度检测荧光免疫分析(1)荧光标记物荧光素类标记物罗丹明类标记物香豆素类标记物藻胆蛋白类标记物生物体液中荧光检测的局限性散射：瑞利散射、拉曼散射、丁道尔散射背景荧光：生物体液含有多种荧光物质，主要影响均相FIA.淬灭效应：血清中的蛋白质胆红素等可以吸收激发或发射光的能量而产生淬灭现象．光漂白作用：荧光分子受到激发光连续照射时会产生光分解而使得荧光强度减小．荧光标记物异硫氰基荧光素(FITC)四甲基罗丹明异硫氰酸酯散形酮荧光免疫分析(2)均相荧光免疫分析荧光偏振免疫分析荧光激发共振能量转移免疫分析荧光淬灭免疫分析底物标记荧光免疫分析非均相荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析酶联荧光免疫分析多重免疫分析均相荧光免疫分析（１）荧光偏振免疫分析(FPIA)荧光偏振值p均相荧光免疫分析（２）荧光激发共振能量转移免疫分析(FETIA)均相荧光免疫分析（３）荧光淬灭免疫分析(FQIA)荧光素标记的标样（抗原）用作示踪剂．示踪剂和被分析物与特异性抗体结合时并不影响示踪剂发荧光．在免疫反应后加入抗荧光素抗体，该抗体与游离示踪剂结合使其与荧光淬灭．由于空间阻碍，抗荧光素抗体不能和与抗体结合的示踪剂结合．均相荧光免疫分析（４）底物标记荧光免疫分析(SLFIA)非均相荧光免疫分析（１）时间分辨荧光免疫分析（１）时间分辨荧光免疫分析（２）时间分辨荧光免疫分析（3）非均相荧光免疫分析（２）酶联荧光免疫分析非均相荧光免疫分析（３）多重免疫分析多重免疫分析指对一个样品同时可进行两个或两个以上成分分析的系统．进行多重免疫分析可采用两种原理，一种是采用光谱不重叠的标记物，另一种则是单一的标记物，但采用空间上的分离．免疫分析发展的趋势基因工程抗体生物素－亲和素（Biotin-(Streptavidin)AvidinCouple,简称ABC）体系自动化和实用化的免疫分析方法基因工程抗体抗独特型抗体:抗独特型抗体的特点是其结合位置是独特型抗体的抗原结合位点(Fab端).抗独特型抗体的结合反应性质类似抗原.双特异型抗体:通过两个不同单克隆抗体细胞系的二次融合杂交和抗体筛选可得到具有两个不同抗原结合位点的抗体(L1H1-L2H2型)双功能抗体:双功能抗体的重链的恒定区部分是酶的结构,其Fab端有两个抗原结合位点.生物素－亲和素体系（Biotin-(Streptavidin)AvidinCouple,ABC）自动化和实用化的免疫分析方法自动化免疫分析仪大众化免疫分析试剂免疫分析法和其它技术的联用大众化免疫分析试剂示例