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1.激活蛋白AP-1是由组Fos和Jun蛋白组成的，它通过调节基因的表达来应对多种刺激。试设计从Hela细胞中分离纯化AP-1的实验方案并说明理由。从Hela细胞中分离纯化AP-1的实验方案从Hela细胞中分离纯化AP-1的实验步骤如下：Hela细胞↓低渗膨胀细胞Dounce氏匀浆低速离心细胞核↓0.42mol/Lkcl提取高速离心硫酸铵沉淀核提取物↓s300凝胶过滤S300峰组分↓序列特异性DNA亲和层析部分纯化的AP-1图示：从Hela细胞中部分纯化AP-1的实验流程图实验一：Hela细胞核提取物的制备。在本实验中，基本上是按照Dignam等所述的方法从Hela细胞中制备核提取物的。首先，将Hela细胞置于低渗缓冲液中孵育，细胞体积因渗透膨胀作用而增大。然后，将膨胀的细胞置Dounce氏匀浆器中匀浆使之裂解，离心收集细胞核。然后，将细胞核置于含0.42mol/LKCl的缓冲液中孵育，提取转录因子AP-1。然后，100000g离心1小时，将溶解状态的转录因子AP-1与细胞核的包膜及基质分开，所得上清液即是细胞核提取物。最后，用硫酸铵沉淀上清液中的转录因子AP-1，再重悬于层析缓冲液中，离心去除不溶物后，即可加载于SephacrylS-300凝胶柱进行层析。注：1.将Hela细胞置于液氮中冷冻保存，温度为-80℃。2.在细胞核的制备过程中，除了特别的说明以外，所有溶液均应保存于4℃，所有操作应在4℃下进行。实验二：SephacrylS-300HR凝胶过滤层析首先，取5mlHela细胞核提取物样品进行凝胶过滤层析，留取50µL提取物供随后的测活分析用。然后，对XK26/40柱，采用下列柱参数：直径=2.6cm,柱长=34cm,体积=180ml,流速=100ml/h，缓冲液=TM缓冲液+0.1mol/lKCL。然后，于S-300柱加5mlHela细胞核提取物样品，分部收集5ml组分。然后，从S-300柱洗脱所得的各组分留取50µl等分试样，供DNA酶Ⅰ足迹分析实验用。然后，各组分在24小时内使用，可储存于4℃；若长期保存，则需液氮保存于-80℃以下。然后，用DNA酶Ⅰ足迹法测定各组分中的AP-1的DNA结合活性。最后，含AP-1活性峰的S-300柱组分可直接上序列特异性DNA亲和层析柱。注：1.所有操作均在4℃环境下进行。2.凝胶过滤层析的关键一步是样品进入填料床。3.蛋白质溶液的冻融是蛋白质化学研究能否获得成功的重要环节之一。实验三：序列特异性DNA亲和层析首先，纯化序列特异性DNA结合蛋白AP-1。然后，非特异性DNA结合蛋白的误纯化。在Hela细胞提取物中，用DNA亲和层析纯化的蛋白质组分中常见的杂蛋白质有两种：一种是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶，分子量为116000Da；另一种是Ku抗原，由分子量为70000Da和80000Da两种多肽组成。然后，亲和层析前DNA结合蛋白AP-1的部分纯化。有几项注意事项对DNA结合蛋白AP-1的纯化很有用的：离子交换层析，肝素-琼脂糖是一种很通用的介质，非特异性DNA-纤维素和DNA琼脂糖凝胶，不含待分离转录因子结合位点的序列特异性DNA亲和介质，麦胚凝集素亲和层析，凝胶过滤层析。最后，亲和层析用寡核苷酸序列的确定。以下几点很重要：寡核苷酸的长度，5´突出端，寡核苷酸序列与DNA酶Ⅰ足迹的关系，合成寡核苷酸的纯度，亲和介质的蛋白接合容量，纯化AP-1和Sp1用的寡核苷酸（1.用制备的凝胶电泳纯化寡核苷酸：使用的是聚丙烯酰胺凝胶，样品以及DNA的回收。2.DNA亲和介质的制备：寡核苷酸的5´-磷酸化，寡核苷酸的连接，偶联Sepharose用DNA制备，用溴化氰将DNA偶联于Sepharose，用CNBr活化的Sepharose将DNA偶联于Sepharose。3.亲和层析中非特异性竞争DNA的正确使用：竞争DNA的选择以及用量估算，竞争DNA的制备。4.亲和层析的操作：全部操作在4℃下进行。讨论：DNA酶Ⅰ足迹分析与凝胶迁移率变动分析优缺点比较：DNA酶Ⅰ足迹分析技术如下：序列特异性结合因子与一单端标记的双链DNA探针一起孵育，使该因子与DNA片段上它的识别位点相结合。然后，能使每条双链DNA产生一个单链切口的条件下，用DNA酶Ⅰ轻度消化结合因子-DNA复合物。而保护因子所结合的DNA区域，使其免于被DNA酶Ⅰ所消化。结果所得的消化后的DNA酶Ⅰ混合物，用凝胶装置进行电泳。放射自显影后，比较有序列特异性DNA结合因子与无特异性的结合因子产生DNA酶Ⅰ消化梯。与不含结合因子的对照相比，在DNA酶Ⅰ消化梯上DNA片段与因子结合的区域显示一条空白带，即为“足迹”。凝胶迁移率变动分析技术如下：DNA结合因子先与标记的双链DNA探针一起孵育，然后该因子DNA-蛋白质复合物在非变性的条件下直接电泳，因子-DNA复合物的迁移率比单独的DNA探针低，由此可以检出该因子与DNA结合的情况。两种方法各有不同的优缺点：DNA酶Ⅰ足迹分析的主要优点就是它直接揭示了因子所结合的DNA区域。而凝胶迁移率变动分析则只显示一个或几个因子，必须要进行一系列的对照实验，以确定是不是该因子所引起的结合。DNA酶Ⅰ的缺点是需要该因子需要有与DNA高效结合的能力。而凝胶迁移率分析是即使只有一小部分探针与因子结合，也可以检测出探针的迁移率的变动。选择该方案的理由：AP-1是一种序列特异性的DNA结合蛋白，但是这些序列特异性的结合蛋白只占细胞核总蛋白的不到0.1%，分析这类蛋白时纯化很重要，但会比较困难。而许多有关亲和层析技术可以用来纯化这种结合蛋白，有一个共同特点就是使用了接有DNA的亲和介质，而该DNA有着特异性识别的位点并固定于固相载体上，而待分离的转录因子比其他的杂质蛋白质更早的结合于亲和介质，这样就可以使结合蛋白质得到很好的纯化。在本实验方案设计中，就用到了DNA介质，其中肝素-琼脂糖就是一种很好的介质。1.从海洋微生物中筛选出一株高产琼胶酶菌株，若要规模化发酵生产纯酶制品，按研究工作顺序应该开展哪些工作？该项工作应该分为三大步骤：琼胶酶的分离纯化，菌株产酶的优化与纯酶制品的规模化发酵生产。首先，琼胶酶的分离纯化。将琼胶酶发酵液于低温下离心除去菌体及未降解的底物,上清液以硫酸铵盐析得沉淀物。沉淀物透析并冷冻干燥得到粗酶粉。将粗酶粉用pH7.5的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液溶解,并平衡DEAE-SepharoseF.F阴离子交换柱(Υ2cm×10cm),上样。用以同样缓冲液配制的0～0.5mol/LNaCl溶液梯度洗脱,流速0.5mL/min,检测波长为280nm,洗脱液分部收集,取有酶活力部分进行冷冻干燥,得干粉。干粉用相同缓冲液溶解,经SephacryS-100凝胶柱(Υ1.6cm×80cm)进一步纯化,洗脱流速0.1mL/min,收集酶活力组分,冷冻干燥,获得纯化琼胶酶制品。然后，菌株产酶的优化。菌株产酶要经过不断的探索与研究，寻找到可以使菌株产酶的最优条件，比如，温度，pH值，培养时间，接种量，氮源以及其他各方面的因素来使其最优化生产酶。最后，纯酶制品的规模化发酵生产。寻找到小规模的产酶条件，然后进一步扩大，并不断调整，使之大规模批量化生产。