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实验设计题目：高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留课程：生物学实验技术概述专业：生物化学与分子生物学学号：2015116105姓名：杨洁舒高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留一、方案必要性与可行性分析我国是水稻种植大国，大米是我国人民的主食，占口粮消费的63％以上。大米除被制成米饭直接食用外，还被加工成米粉、甜点及酒精饮料等。我国大米人均年消费量在140kg以上。水稻生产中为了保证水稻的高产，往往不可避免地需要使用各种农药。据报道，在农药的使用过程中，真正起作用的仅占喷施量的0.1%，其余99.9%的农药都分散于环境中，中国每年受农药污染的农田面积达到6.67×106hm2。因此，在大米的进出口中，世界各主要农业大国都对大米的农药残留制定了严格的限量标准。研究大米中农药残留的检测方法，既是保障人类健康的需要，又是促进进出口贸易的需要。为了保证水稻的产量，种植者施用大量的化学农药，不仅造成环境污染，而且直接影响大米的食用安全，威胁人们的健康。鉴于上述原因，世界各国严格规定了包括大米在内的食品中农药最大残留限（MRLs）和每日最大摄入量。目前大部分实验室监测食品中农药残留的方法是采用经典的气相色谱法，选择性检测器包括电子捕获检测器（ECD）、氮磷检测器（NPD）和火焰光度检测器（FPD），然而这些检测器限制了农药残留的检测范围。其原因是萃取共存物的干扰存在假阳性和不准确性，用单一方法检测呈阳性后，还必须做确证试验。此外，经典的预处理方法操作复杂，耗时且溶剂消耗量大，因此，有必要研究新的样品预处理及检测方法。随着联用技术的日趋完善,高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）逐渐成为最热门的分析手段之一。特别是在分子水平上可以进行蛋白质、多肤、核酸的分子量确认,氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等,这在HPLC-MS联用之前都是难以实现的。HPLC一MS作为已经比较成熟的技术,目前国内外己在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。HPLC-MS技术除了可以分析气相色谱-质谱（GS-MS）所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性的化合物之外，还具有以下几个优点：、分析范围广，MS几乎可以检测到所有化合物，比较容易的解决了分析热不稳定化合物的难题；、分析能力强，即使被分析混合物在色谱上没有完全分离，但通过MS的特征离子质量色谱图也能也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量；、定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；④、检测限低，MS具备高度灵敏，通过选择离子（SIM）检测方式，其检测能力还可以提高一个数量级以上；⑤、分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱株为窄径株，缩短了分析时间，提高了分离效果；⑥、自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。二、技术路线三、方法和步骤1.材料与方法1.1仪器和试剂安捷伦AgilentTechnologies1200SLSeries液相色谱串联G6410A质谱仪，同时配置G1948B电喷雾离子ESI源。甲醇、乙腈等均为色谱纯，购自德国Merck公司。甲酸为色谱纯，购自美国TEDIA公司。水取自Milli-Q超纯水系统。采集20个地区的不同新大米样品20份，分别测定。并将大米用粉碎机粉碎选取合适的溶剂制备样品溶液，预处理后使用液质联用仪进行样品分析依据色谱质谱条件，选择离子扫描定性、定量分析数据处理与分析把各农药标准储备液的标准工作液加入大米空白中材料准备材料处理样品制备数据测定结果与分析1.2溶液配制农药标准品吡蚜酮(Pymetrozine）、氧化乐果(Omethoate)、敌百虫(Trichlorphon)、啶虫脒(Acetamiprid)、乐果(Dimethoate)、多效唑(Paclobutrazol)、烯唑醇(Diniconazole)、喹硫磷(Quinalphos)和甲基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin-benzoate)均购自农业部环境保护科研检测所，标准品保存于－20℃的冰箱中。称取各农药纯品0.01g(根据标样含量折算至0.01g有效成分)，用乙腈配置各农药单标1000μg/ml，储存于冰箱中备用。1.3流动相的配备流动相A：准确称取0.134g乙酸铵，溶解在1000mL乙腈中，加入适量甲酸(0.15%)，过0.22mm有机相滤膜。流动相B：准确称取0.134g乙酸铵溶解于1000mL的水中配成浓度为2mmol/L的乙酸铵溶液，再加入1mL甲酸配制为流动相B，过0.22mm水相滤膜。2.实验步骤2.1样品前处理将大米用粉碎机粉碎，称取每个待测样品各5.0g(精确到0.1g)样品于50.0ml离心管中，加入0.1%(体积分数)冰醋酸-乙腈20.0ml，盖上离心管盖，漩涡混匀，超声波处理10min，振荡提取2h。加入3g无水硫酸镁和1g无水乙酸钠，漩涡混匀。4000r/min离心5min，取出上清液，50℃水浴氮气吹干。加入含0.1%甲酸的甲醇0.5ml，漩涡30s，加入0.1%甲酸的超纯水0.5ml，漩涡30s，加入氨基柱填料0.04g，漩涡混匀，过0.22μm的滤膜到进样小瓶中，供液质测定。2.2标准曲线与线性范围用空白样品提取液配制各农药系列浓度在10～1000ng/ml内作标准曲线。将测得的农药浓度和农药峰面积作直线回归，求曲线回归方程和相关系数。2.3回收率与变异系数的测定把各农药标准储备液的标准工作液加入5.0g各个大米空白中，制得对应浓度分别为5.0μg/kg、50.0μg/kg、100.0μg/kg的3个添加浓度水平，放置1h，按照方法1.3和1.4进行，1d之内样品重复3次，共重复3d。以峰面积定量，求回收率和变异系数。3.仪器基本操作和维护保养3.1色谱、质谱条件与工作指标色谱条件:色谱柱为ZORBAXSB-C18Narrow-Bore2.1mm×150mm5-Micron，柱前使用1cm长C18预柱，流动相为乙腈∶水∶甲酸(体积比为50．0∶50.0∶0.1)，流速为0.4ml/min，进样量5μl。质谱条件:电喷雾ESI源，雾化气为氮气，压力为172kPa;干燥气为氮气，流速为10L/min，温度为350℃;毛细管电压为4000V;质谱为多反应监测(Multiplereactionmonitoring，MRM)模式，碰撞气为高纯氮气，根据具体农药分子特性确定传输区电压和碰撞能量。离子传输毛细管温度：250℃。3.2仪器基本操作1开机2质谱调谐窗口各项参数设定3创建项目4质量校正5调谐（Turning）6信号采集7泵、进样器和检测器的条件设置8创建质谱方法9创建样品列表10运行样品列表11编辑定量方法12批处理13查看定量结果14关机3.3维护和保养a.LC/MS/MS仪器应定期检查，并有专人管理，负责维护保养。b.实验完毕要清洗进样针，进样阀等，用过含酸的流动相后，色谱柱，离子源都要用甲醇/水冲洗，延长仪器寿命。c.定期清洗样品锥孔，关闭隔断阀，取下样品锥孔，先用甲醇：水：甲酸（45：45：10）的溶液超声清洗10分钟，然后在分别用超纯水和甲醇各溶液超声清洗10分钟，待晾干后再安装到仪器上。当灵敏度下降时，需要清洗Source、二级锥孔和六级杆。d.定期（对于ESI源，至少每星期做一次；对于APCI源，每天做一次）逆时针方向拧开机械泵上的GasBallast阀，运行20分钟。定期（每星期）检查机械泵的油的状态，如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，要及时更换机械泵油。四、拟采用的数据处理的形式和方法质谱仪都配有完善的计算机系统，不仅能快速准确的采集数据和处理数据，而且能监控质谱仪各单元的工作状态，实现质谱仪的全自动操作，并能代替人工进行化合物的定性和定量分析。可选用的软件有诸如Xcalibur、PD以及MetaboliteID等。数据处理方法主要运用列表法与作图法相结合的方式，利用列表法规则地记录原始数据与运算数据，所有处理的定量计算取多次重复的平均值作为最终数据。而利用作图法明确合理地揭示几个量之间的变化规律，显示其数量关系，并进一步求出标准差作为柱状图上标。五、可能的结果预测与分析1.结果预测：试验中液相的流速为0.4ml/min，质谱部分的干燥气温度设定为350℃，流速10L/min。结果显示，空白样品MRM图基本没有基质干扰峰出现，添加农药的20个样品MRM色谱图中应该都有干扰峰存在，并且与添加的农药种类数大致一样，这说明大米中有农药的残留。2.分析：各个待测样品中均含有与添加农药的样品一样的峰，说明每个大米样品中均含有农药的残留。待测样品中的峰与哪类农药抑制，说明含有哪类农药。本试验前处理采用了固相分散萃取净化方式，节省了大量的时间和有机溶剂的消耗。为进一步确保由于简单提取而可能导致的无色杂质对质谱的污染，本试验在液相部分加入了一个C18预柱，并且每进100个左右样品更换新的预柱，以维护质谱的干净同时提高工作效率。并且为了目标分析物在质谱的电喷雾离子源(ESI)部分能较好地离子化，前处理部分采用含0.1%甲酸的乙腈水混合溶剂定容，以增加加氢峰的可能。3.讨论：液质联用方法检测水稻中多农药残留，不仅可以在简化前处理过程的同时，减少大量杂质峰的干扰，而且可以利用特征离子的优势进行多残留检测，特别是保留时间和特征离子可以双重定性，既提高方法的检测效率又提高方法的准确性。本试验中参考了目前农药检测领域中较为热点的一种快速、简便、价格低廉、高效、安全的分析方法—QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)方法，并作了一定的改进:采用酸性乙腈提取;减少过滤的步骤，加入离心的方式;去除固相萃取过程，采用固相分散萃取。方法的改进提高了检测速度，减少了有机溶剂的消耗，简化了操作过程，简单易行。建立的农药残留检测方法简单快速、选择性好、准确度和精密度高，能有效消除基质干扰，可以用于大米中农药残留的检测。该方法的关键是找出各种农药合适的母离子和子离子，并确定定量子离子，在简化前处理的同时又能保护仪器。