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生化工程实验实验1图示工业化生化工程产品分离技术指导老师：刘金龙1.目的通过图片演示工业化发酵液或酶反应液分离纯化生物产品技术，让同学掌握生化产品分离技术的一般过程和发展及生物技术下游加工技术，为到实习单位和毕业进工厂打基础。2.原理根据生化产品纯化步骤多，操作繁琐，产品收率低、生产成本高。分离纯化的产品通常稳定性差，容易失去生物活性，或被分解、降解。从发酵液中分离产品时，不宜存放太久，应尽快提取的特点。应用分离设备和生化分离理论及技术分离生化工程产品。3、工艺流程一般分为四个阶段：（1）发酵液的预处理和固液分离（2）初步分离（3）产品提纯（4）成品加工一般工艺流程4、分离过程4.1.预处理和固液分离预处理：改变反应液的性质（发酵液），有利于固液分离。通常通过酸化和加热降低发酵液的黏度；加入絮凝剂，使细胞或大分子聚结成较大颗粒。固液分离：常用过滤、离心等方法板框压滤机、鼓式真空过滤机，应用最广泛的是碟式离心机板框压滤机通常发酵完成后，发酵罐内充满了残余的培养基、水、微生物和酶所形成的大量发酵液。可用真空转鼓过滤机将酶与发酵液的其他成分分离开来。鼓式真空过滤机过滤机外涂有厚厚的一层硅藻土，水和酶可以渗透过去，而培养基和微生物却被黏着在硅藻土表面上。鼓式真空过滤机鼓式真空过滤机转鼓过滤机旋转的过程中，发酵液喷散开来。水和酶被吸进过滤机的中央，培养基和微生物则留在硅藻土表面，稍后用巨型刀片将硅藻土及附着其上的培养基及微生物一同去除。离心澄清机的转鼓内有数十个至上百个形状和尺寸相同、锥角为6O0～1200的锥形碟片，碟片之间的间隙用碟片背面的狭条来控制，一般碟片间的间隙约0.5～2.5mm。当具有一定压力和流速的悬浮液进入离心澄清机后，就会从碟片组外缘进入各相邻碟片间的薄层隙道，由于离心澄清机高速旋转，这时悬浮液也被带着高速旋转，具有了离心力。此时固体和液体因密度不同而获得的离心沉降速度的不同，在碟片间的隙道间出现了不同的情况。碟式离心机固体颗粒获得的离心沉降速度大于后续液体的流速，则有向外运动的趋势，就沿碟片下表面离开轴线向外运动，并连续向鼓壁沉降；澄清液获得的离心沉降速度小于后续液体的流速，则在后续液体的推动下被迫反方向向轴心方向流动，移动至转鼓中心的进液管周围，并连续被排出。这样，固体和液体就在碟片间的隙道流动的过程中被分开。碟式离心机碟式离心机碟式离心机是立式离心机的一种，转鼓装在立轴上端，通过传动装置由电动机驱动而高速旋转。转鼓内有一组互相套叠在一起的碟形零件--碟片。碟片与碟片之间留有很小的间隙。悬浮液（或乳浊液）由位于转鼓中心的进料管加入转鼓。当悬浮液（或乳浊液）流过碟片之间的间隙时，固体颗粒（或液滴）在离心机作用下沉降到碟片上形成沉渣（或液层）。沉渣沿碟片表面滑动而脱离碟片并积聚在转鼓内直径最大的部位，分离后的液体从出液口排出转鼓。碟片的作用是缩短固体颗粒（或液滴）的沉降距离、扩大转鼓的沉降面积，转鼓中由于安装了碟片而大大提高了分离机的生产能力。积聚在转鼓内的固体在分离机停机后拆开转鼓由人工清除，或通过排渣机构在不停机的情况下从转鼓中排出。碟式分离机可以完成两种操作：液-固分离:即低浓度悬浮液的分离，称澄清操作；液-液(或液-液-固）分离:即乳浊液的分离，称分离操作。碟式离心机HPLCA-供料B-澄清产品出口C-固体出口D-废料去灭菌工序E-蒸汽F-仪表用空气G-无菌水H-冲洗水I-生产水补给水J-生产水，排放水K-生产水出口L-夹套冷却水，进口M-夹套冷却水，出口N-轴封水O-排风P-排水Q-冷凝水去灭菌工序1-离心机2-控制装置3-电动机起动器4-固体贮罐5-废料贮罐6-隔膜阀7-球阀8-气动隔膜阀9-止回阀10-针阀11-空气减压阀12-恒压阀13-取样旋塞14-恒流阀15-凝汽阀16-无菌空气过滤器17-观察镜18-压力指示器(气压计)19-流量计20-温度传感器21-液面传感器碟式离心机适合于细菌、酵母、放线菌等多种微生物细胞悬浮液及细胞碎片悬浮液的分离。它的生产能力较大，最大允许处理量可达300m3／h，一般用于大规模的分离过程。碟式离心机蒸发，萃取，沉淀以及膜分离等方法（1）蒸发外循环式真空蒸发器三效降膜式蒸发器4.2.初步分离有机溶剂萃取：在抗生素的生产中占有重要的地位。利用萃取法提取某些酯溶性的抗生素，具有质量好，收率高速度快等优点。离心萃取机（2）萃取有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。双水相萃取：用两种不相溶的高聚物，如聚乙二醇和葡聚糖，进行萃取，而不用常规的有机溶剂为萃取剂。其特点是两相内均含水高于75%，故称双水相。该法得到的双水相可用倾析法和离心法分离。然后再用超滤法等提取目的产物和回收高聚物。双水相萃取的优点①使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；②适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；③亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（85～95％），这样生物活性蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。双水相的形成1.如两种聚合物间存在强的吸引力，则它们结合后存在于一相中；如两种聚合物间有斥力，即某种分子希望在它周围的分子是同种分子而不是异种分子，达到平衡后会形成两相，两种聚合物分处一相。2.加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。常用聚合物：聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－无机盐系统无毒原则影响分配的系数聚合物的分子量聚合物的浓度盐类pH值分子量越小，蛋白质容易分配于富含该聚合物的相中。当接近分配的临界点蛋白质均匀分配于两相中，分配系数接近1；成相聚合物的总浓度或聚合物/盐浓度的比例增加时，系统远离平衡点，此时两相性质的差别增加，蛋白质容易趋向于某一极。盐浓度增加促使蛋白质两极分化对物质解离度影响目前已知的胞内酶约2500种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。双水相萃取法常用于胞内酶提取。双水相萃取的应用用双水相萃取胞内酶，PEG/盐系统应用的较广泛。通常将目的蛋白质分配在上相（PEG），而细胞碎片分配在下相（盐），便于离心分离。双水相提取胞内酶的具体操作：萃取：适量的细胞匀浆液与双水相体系（一般为PEG/盐）混合。上下相的分离：在萃取达到平衡后，就必须使上下相分离。有两种方法：重力沉降和离心分离。多聚物的分离：当目的蛋白是分配在PEG富集的上相中，相与相分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相体系，在适当的条件下，蛋白质重新被萃取进入盐相，而大量的PEG得到回收，盐相中残余的PEG可用超滤或透析除去。三步双水相萃取流程图要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：①欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；②酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率；③两相用离心机很容易分离。(3)沉淀：降低蛋白质溶解度，如等电点沉淀、盐析等。(4)膜分离：膜分离是基于一种半透性薄膜，使溶液中的某些组分通过，而阻止或截留其它组分的分离方法。它包括反渗透法(ReverseOsmosis)和超滤法(Ultrafiltration)。依据物质粒度大小这一几何特性的差异，来分离物质，而不必像萃取、沉淀法中那样，需要加入其它物质(溶剂、盐类)，也不必像蒸发那样，需要加热。因此，使用膜分离法分离，产品的损失很少。膜分离法的优点若干生物物质的粒度特征渗透和渗透压1885年,Van’tHoff渗透压定律：·R·T·Ci渗透是在膜两边渗透压差-的作用下的溶剂流动；而反渗透、超滤是在一外加压力差P的作用下,溶剂逆向流动。盐溶液纯水H2O渗透P反渗透当某溶液与某纯溶剂之间被一半透性薄膜隔开时，由于系统中的渗透压作用，纯溶剂将会通过膜层而进入溶液相，此即为渗透现象。如果在溶液上方施加压力，溶剂渗透的速率便减小；当P等于渗透压时，渗透即停止。如果进一步增加外压，当P超过渗透压”时，纯溶剂便反向渗透，即从溶液渗向纯溶剂，这就是反渗透。反渗透的结果，将使溶液被浓缩。渗透和反渗透渗透与反渗透用双级反渗透设备除盐的技术称为两级反渗透技术，两级反渗透装置可除去原水中99%以上的盐份。超滤通常使用孔径较大的薄膜，截留的分子也较大。由于超滤允许较大的分子通过，既有浓缩的作用，又有纯化的作用。如在酶制剂的制备过程中，即可用超滤法同时实现浓缩和纯化。反渗透则只允许溶剂通过，较大的盐类分子也有可能被截留，所以，反渗透只起浓缩作用。超滤：常见膜分离装置中空纤维超滤器超滤装置是以毛细管式超滤膜为核心设计制造的，其超滤膜微孔可达0.01微米（十万分之一毫米）以下，因而过滤精度高。生化产品提纯，常用层析法(Chromatography)。所谓层析法，是在一根层析柱内，填充以某种特殊的载体物质(称固定相)；含有被分离物质的混合物(称流动相)，则流经层析柱。由于混合物内各种物质在某种性质上的差异，导致与固定相之间产生的结合力不同，因此，各种物质在柱内的停留时间也就不一样，它们将依次流出层折柱，据此，便可把它们分离。5.产品提纯吸附层析法：利用各种物质与固定相之间的吸附力差异离子交换层析法：利用各种物质带电特性的差异分子筛层析法：利用各种物质的几何大小特性的差异亲和层析法：利用物质在生物特性方面的差异层析种类层析分离，多数是分批操作，但近年来，已出现了小规模的连续层析装置。见下图：层析的装置生产时，料液在缓慢旋转着的环状层析柱顶端的某点加入．截流溶掖则在顶端的其它各点加入。对具有较大k值的组分言，因它通过层析柱较馒，故在它流出柱层并集于底部的收集管之前将沿着层析柱的环状周边旋转一段较长的距离(如区带B)，而k值较小的组分，则很快就流入集留管(如区带A)。如此，在不同的收集管内，便可获得不同的蛋白质。该法的缺点是需要耗费较多的截流溶液。连续层析装置示意图干燥：通常是生化产品分离的最后一步。由于很多生物产品，如味精、柠檬酸、酶制刘、抗生素及单细胞蛋白等均是固体产品，故干燥操作在生化工业中十分重要。6.产品的最后分离干燥的目的：去除物料中的水分，便于产品的保存和运输。干燥的设备：工业生产中常用的干燥设备类型很多，但由于生物产品大多为热敏性物质，所以在对干燥设备的选用时须注意这一问题。一般用于生物产品干燥的设备，必须是干燥时间不太长，温度不过高的设备。（1）喷雾干燥喷雾干燥的原理：利用不同的喷雾装置，如喷嘴或转盘等，将浓缩液或悬浮液喷成雾状，使形成具有巨大表面积的分散液滴，在干燥室内缓缓沉降，并与热空气流发生强烈的热、质交换，迅速排除水分，在几秒至几十秒时间内，便获得干燥。成品以粉末状沉降于干燥室底部，连续或间断地排出。逆流喷雾干燥器示意图逆流喷雾干燥器：是生物产品生产中常用的干燥装置，它不仅是干燥，还包括有造粒、蒸发及分离固体干燥物等一系列过程。喷雾干燥由于干燥时间极短，避免了产品的破坏，故适合于抗生素、酵母粉和酶制剂等热敏性物料的干燥。气流干燥器的原理：利用颗粒在气流中自由流动的特性，使物料随气流一起流经一段长的管道，颗粒物料在与热空气一起流动的过程中，由于热空气与湿物料充分接触，水分汽化迅速，故待至干燥管道出口处，颗粒物料已被干燥。（2）气流干燥近年来崛起的一种新型干燥设备。它的优点与喷雾干燥器相同，也可在极短的时间内(数秒钟内)完成干燥操作，但它只适用于颗粒状物料。气流式干燥器待干燥物料经加料器，均匀地进入干燥器的底部。空气被鼓风机抽吸，进入空气加热器，被加热至80一90℃，然后进入气流干燥管的底部，与被干燥物料汇合。在经过约10m高的干燥管后，物料已被干燥完毕，进入旋风分离器，把固体与废气分离。干燥的物料由分离器的底部排出，废气最后被排至大气中。气流干燥器的优点干燥时间短、干燥强度大、设备简单紧凑(仅一根数米至数十米长的垂直管道)，即可把干燥、粉碎、运输、包装等多道工作合于一道工序内完成。适用于味精、