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绪论海洋生化工程：以海洋生物学为基础，利用陆地生化工程和工程原理，将海洋生物技术实验室研究成果推向产业化的一门新兴的综合性学科。生化工程（生物分离）的对象:1、胞外产品:产物作为细胞的代谢产物被分泌于培养液中2.胞内产品:产物被留在细胞内部a.以包涵体(inclusionbodies)形式存在b.在细胞周质内或细胞的其它部位3.天然产物:不需经过细胞培养或发酵的体系，包括固体物、固体的提取物以及各类溶液分离分类：机械分离、输送分离、平衡分离微藻及微藻生物技术微藻生物技术:概念：以微藻生物学为基础，利用微藻生物体系和工程原理，提供商品和社会服务的综合性科学。本质：利用太阳能大量生产生物量，用作人类的有机资源。微藻：概念:指在显微镜下才能辨别其形态的微小藻类类群。微藻的特点：具有叶绿素等光合器官；分裂式繁殖，周期短，易大规模培养；可用海水、咸水或半咸水培养；富含蛋白质、脂肪和碳水化合物等；能合成生物活性物质。光生物反应器：概念：指能用于光合微生物及具有光合能力的组织或细胞培养的一类装置，与一般的生物反应器有相似的结构，有光、温度、溶解氧、CO2、pH值和营养物质等培养条件的调节和控制系统。开放式光生物反应器优缺点：优点：构建简单、成本低廉、操作简便缺点：易受外界环境影响，难以保持较适宜的温度和光照会受到灰尘、昆虫及杂菌的污染，不易保持高质量的单藻培养光能及CO2利用率不高，无法实现高密度培养密闭式光生物反应器的优点无污染，能实现单种、纯种培养培养条件容易控制培养密度高，易收获适合于所有微藻的光自养培养，尤其适合于微藻代谢产物的生产有较高的光照面积与培养体积之比，光能和CO2利用率高等微藻的生长动力学研究是实现高密度培养、降低生产成本的理论基础。微藻的生长动力学：1、微藻生长的特点：微藻是生化反应过程的主体2、微藻生长的本质：复杂的酶催化体系3、微藻的生长过程：复杂的反应过程微藻生物量产量的测量1、藻体细胞计数：血球计数板计数2、吸光度值：最适波长；藻细胞密度与吸光度值的关系曲线3、生物量干重的测量：方法：取10ml培养液在4500r/min的转速下离心15min后弃上清液，以pH=4的酸化水洗2遍后用PallA/B膜过滤，于105℃烘至恒重后以精密分析天平称量。微藻大规模培养的三个关键因素：高效率地捕获和利用光能；高效率地吸收和利用营养；优化微藻的培养工艺条件微藻的最适培养密度在特定的培养环境下能使微藻细胞能以最大或最高的速率生产微藻细胞生物量或某种所期望的微藻产物时的培养密度。光反应光反应包括光能的吸收、传递和转换等过程。其最终电子供体是（H2O），最终受体是（NADP+）。反应结果产生了固定和还原CO2所需的（能量ATP）和（还原力NADPH2),即光合同化力，同时产生（O2）。暗反应暗反应实质上是一个酶化学反应过程，这一过程主要受CO2浓度、温度和其他有关培养条件的影响和调控，是固定（CO2）的具体过程，其基本转化途径就是（磷酸戊糖还原途径或称卡尔文途径）。在一次循环中，必须动用光反应中合成的（12）分子NADPH和（18）分子ATP.Ic：光补偿点，指光合作用形成的物质与呼吸作用消耗的物质相互抵偿时的光强度，与微藻的种类、生态型有关；Ik：光饱和点，表示光合作用达到最大速度时的光强度，也是光反应最大速度和暗反应最大速度的比值。光抑制当光强达到饱和状态时，此时如果不设法改善暗反应的条件，而是仍然继续增加辐照，则会因为过强的光照导致光合色素的氧化和细胞中的某些酶受到氧化伤害而使光合速率开始下降。光衰减现象定义：当光辐射通过培养液时，随着光子的被吸收、反射和散射等而造成的光子通量密度（Photonfluxdensity,PFD）减少的现象。控制外来生物污染方法1、大量接种，利用数量优势使培养的微藻细胞快速达到最适培养密度从而有效地抑制外来生物的生长繁殖；2、控制培养温度或某些特殊培养成分的含量，调节pH值或者利用高浓度的盐分抵御外来生物的入侵；3、利用某些既不影响微藻细胞的生长又对外来生物具有杀灭作用的化学试剂。微藻毒素引发赤潮的微藻有300多种；甲藻硅藻针胞藻蓝藻定鞭藻等海洋生物活性物质海洋生物活性物质（MarineBioactiveSubstances）指海洋生物体内所含有的对生命现象具有影响的微量或少量物质，主要包括海洋药用物质、生物信息物质、海洋生物毒素和生物功能材料等海洋生物体内的天然产物。海洋生物活性物质的特点种类繁多、结构特异；活性高；资源有限，含量通常都很低；获得难五碳糖六碳糖DL型五碳糖吡喃型糖，C4位（从不对称炭逆时针数）的羟基在上为L型，在下为D型，五碳糖呋喃型糖，C4位（从不对称炭逆时针数）的羟基在上为D型，在下为L型，六碳吡喃型，C4位（从不对称炭逆时针数）的羟基在上为D型，在下为L型，α，β型五碳糖6元吡喃型糖，乳醇基和C4位羟基同面为α型，异面为β型五碳糖5元呋喃型糖，乳醇基和C4位R基同面为β型，异面为α型六碳糖6元吡喃型糖，乳醇基和C5位R基同面为β型，异面为α型微藻活性物质不饱和脂肪酸（PUFA）：二十碳五烯酸（EPA）二十二碳六烯酸（DHA）花生四烯酸（AA）藻胆蛋白：藻红蛋白（PE）藻蓝蛋白(PC)藻红蓝蛋白(PC)别藻蓝蛋白(PEC)微藻色素：叶绿素（占干重１％－６％）叶黄素胡萝卜素藻胆素（藻蓝素和藻红素）其他色素（血球藻含有虾青素）清除氧自由基抗氧化作用的物质虾青素、β-胡萝卜素，维生素E，藻胆蛋白藻胆蛋白结构测定方法直接测定测定相应基因的核甘酸序列再反推其氨基酸序列藻蓝蛋白含量分析方法：紫外可见分光、滴定原理：基于螺旋藻中藻胆蛋白吸收光谱不同。藻胆蛋白的应用研究范畴用作天然色素；作为药物；作为荧光探针提取方法：反复冻熔、超声波、溶菌酶等来破碎细胞；离心、过滤（粗提液）；盐析、透析、离心、层析等（纯化液）。通常采用的层析法是羟基磷灰石柱层析，所用的洗脱液为梯度浓度的磷酸盐缓冲液。抗氧化剂：β胡萝卜素，虾青素，海藻硫酸多糖，褐藻多糖海洋生物毒素：1、内源性2、外源性河豚毒素：胍胺类西加毒素：醚类海葵：肽类箭毒蛙：甾体生物碱五大类生物毒素：麻痹性贝毒PSP腹泻性DSP神经性NSP记忆性缺失ASP西加毒素CFP特点：化学结构新颖，作用机制特殊，高生物活性DHA二十二碳六烯酸：1、降压、降脂、降胆固醇等，预防和治疗心血管疾病2、预防和治疗癌症、炎症、糖尿病等，提高人体的免疫调节机能；3、促进脑细胞的生长发育，改善脑的机能。不饱和脂肪酸PUFA：传统上：鱼油；真正的生产者：微藻鱼油中提取的PUFA存在的问题：1、构成和含量随着鱼的种类、季节、地理位置变化；2、胆固醇含量高，并带有腥味；3、加工过程中的氢化处理降低了产量；4、复杂的处理过程，价格昂贵。利用微藻生产PUFA的优点：1、含量高；2、无腥味，不含胆固醇；3、种类单一，分离纯化容易；4、繁殖周期短，容易进行大规模培养；5、可进行基因改造，合成单一的PUFA第四章海洋生物活性物质制备技术海洋生化制备概念从海洋生物材料中对各种化合物进行分离、提取、纯化，获得目的产物（主要是海洋生物活性物质）的方法与技术。海洋生化制备技术的特点成分组成非常复杂；含量微；稳定性差；制约因素多；分离程序复杂；均一性或纯度的检验比较复杂海洋生化制备的一般过程发酵液或培养液或海洋生物材料→（胞内产物→细胞破碎）（胞外产物）→固液分离→浓缩→初步纯化→纯化→精制→产品预处理方法粉碎或匀浆；凝集与絮凝；加热；调节pH值；稀释；加入助滤剂对干燥固体行原料先粉碎，新鲜海洋生物原料则需匀浆处理，对植物类物料细胞破碎细胞破碎细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁和细胞膜，细胞壁和细胞膜的结构决定了其破碎方法的选取；方法：:按照是否施加外力可分为机械法和非机械法两大类。细胞破碎的目的是释放出细胞内含物机械法：1、固体剪切作用：珠磨法、压榨2、液体剪切作用：高压匀浆、超声破碎非机械法1、干燥处理2、溶胞作用：化学法、物理法、酶溶法离心机的种类低速离心机：细胞和细胞核；高速离心机：细胞器；超高速离心机：蛋白质离心分离法差速离心(最常用于生化工业)：污染（小分子粘附在大分子上），分离精度有限（相似性质的分子难以分开），振动和对流的影响；密度梯度离心(常用于生化研究,如蛋白质、核酸分离)；工业：管式---可以冷却碟式----可以连续操作过滤利用薄片形多孔介质（如滤布）截留固体悬浮液中的固体颗粒；分为死端过滤和错流过滤膜的过滤操作有死端过滤（用于无菌过滤，污染严重，用于金贵药品提纯，一次性）和错流过滤（1、污染轻2、便于连续操作3、有效改善液体分离过程4、提高过滤速度）不同类型过滤装置的特点：管式：优点易清洗，无死角缺点保留体积大，单位体积过滤面积小中空纤维式：优点保留体积小，单位体积过滤面积大缺点需要预处理，单根纤维损坏时，需调换整个膜件螺旋卷绕式：优点过滤面积大，换新膜容易缺点需要预处理，易污染，清洗困难平板式：优点保留体积小，能耗在管式和螺旋之间缺点死体积较大膜分离利用半透膜作为选择性隔离层，有选择性地允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离纯化的目的。膜分离的特点及主要问题不涉及相变，对能量要求较低；无化学变化，分离条件较温和；具有设备简单、操作方便、易于自动化、处理效率高等优点。问题：1、膜易受污染2、耐受性有限3、效果有限膜材料的基本要求膜材料为惰性，不吸附溶质（蛋白质、细胞、细胞碎片等），膜不易污染，膜孔不易堵塞；起分离作用的有效膜厚度小，超滤和微滤膜的开孔率高，过滤阻力小；适用的pH和温度范围较广，需要耐高温灭菌，耐酸碱，稳定性高，使用寿命长；满足分离的各种要求，如对菌体细胞的截留、对生物大分子的通透性或截留等；容易通过适当的清洗恢复透过性能，重复利用率高。膜分离的分类微滤膜孔径20~10000nm超滤2~50nm纳滤2反渗透1渗透汽化0.5浓差极化在膜分离过程中，一部分溶质被截留，在膜表面及靠近膜表面区域的浓度越来越高，造成从膜表面到本体溶液之间产生浓度梯度，这一现象称为“浓差极化”。浓差极化不利影响，如何减小影响影响：操作压力必须相应提高，膜的传质阻力大为增加，膜的渗透通量下降减小：1、提高液料的流速2、增加湍流促进器3、采用膜冲形式进料4.提高温度电渗析电渗析是一种电化学过程，利用膜和电位差从水溶液和其它带荷电的混合物中分离离子物质的膜过程。渗透汽化在膜两侧压差（跨膜压差）作用下，料液侧混合物中优先组分渗透通过膜，并在膜的另一侧表面上汽化，达到混合物脱水（易挥发溶质)与分离，获得纯化产物的一种新型膜分离技术。膜组件由膜、固定膜的支撑物、间隔物以及容纳这些部件的容器构成的一个单元（unit）。管式、板框式、卷式、中空纤维式膜分离过程的影响因素（1）操作形式：减轻浓差极化或减小凝胶层厚度（2）流速：流速升高，传质系数增大，透过通量增大（3）压力：因此操作压差愈高，渗透通量增大，但压差增大往往导致浓差极化的增加；操作压差的增大将导致能耗增加（4）其它：1、料液的预处理：处理料液以增加分离过程的效率。调整pH值2、温度：升高有利于降低浓差极化影响，提高膜的渗透通量，但导致能耗增大，寿命影响3、膜的清洗：污染，导致膜通量的下降，需要清洗。膜清洗的方法有两种：物理清洗和化学清洗（1、用草酸、柠檬酸或EDTA等配制的清洗液除去金属氧化物沉淀；2、加酶洗涤剂对有机物，特别是蛋白质、多糖类和油脂类污染物有较好的清洗效果。3、双氧水溶液除有机物4、胶体堵塞，可用尿素、硼酸、醇等作清洗剂）沉淀分离法沉淀法也称溶解度法，其纯化物质的原理是根据物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团比例的差异）来改变溶液的某些性质（如pH值、极性、离子强度、金属离子等），使提取液中有效成份的溶解度发生变化，从而达到从提取液中分离有效成份的目的。沉淀分离的优缺点技术成熟、设备简单、成本低、原料易得、便于小批量生产；所得沉淀物中可能聚集有多种物质，含有大量盐类或包裹着溶剂，产品纯度低盐析法一般在低盐浓度的情况下，各种生物分子的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当盐