生化技术复习资料

生化制备概论一制备主要对象及特点蛋白质：易降解易变性多样性多种因素影响活性核酸：分子量大，易被机械切割力破坏（基因组DNA）易降解（酶解）特别是RNA常与核蛋白质结合多糖：成分复杂多样，分析困难，糖苷同样也会被多种酶降解脂类：种类多，成分复杂，分析仪器要求较高二物质的提取与缓冲溶液针对蛋白质的操作一般要注意的问题：基本原则：防止生物分子变性、降解1．控制适当的pH2．控制低温3．注意提取过程中的溶液环境4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基1低温0~4度。2缓冲溶液提取操作，适度的离子(盐)浓度。3加保护剂\酶抑制剂，如巯基乙醇、DTT,，Vc,PVP,重金属络合剂，酶的底物蛋白酶抑制剂等等4操作连续，尽量快速。5避免剧烈搅拌。蛋白质的溶液提取（抽提）水溶液提取：大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，是提取蛋白质的最常用溶剂。盐浓度等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L碳酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L以上氯化钠液提取PH值：蛋白质提取液的PH值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果细胞破粹方法：1、高速组织捣碎：将材料剪小，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感物质和核酸应慎用。4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。6渗透冲击：用蒸馏水冲击细胞或经过高渗液处理（平衡）过的细胞，让细胞内容物释放出来无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入对苯甲基磺酰氟（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部。表面活性剂的利用：对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（TritonX-100、NP-40等）、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。膜蛋白提取注意事项常用去垢剂：SDSTween2040…TritonX-100CHAPS三蛋白质的基本操作盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析分段盐析，有机溶液沉淀目的纯化浓缩保存注意事项影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。样品保存溶液状态冷藏保、冷冻保存、液氮保存干粉状态真空干燥、喷雾干燥、冰冻干燥、脱脂样品、丙酮干粉蛋白质含量的测定变性不溶解蛋白质凯氏定氮法“可溶”蛋白质（蛋白质溶液）1双缩脲法（Biuretassay）2劳里反应（Lowryassay）Folin-酚法3巴福得测定法（Bradfordassay）标准曲线4UV(紫外分光光度)法AbsorbanceassaysAbsorbanceat280nm–Range:20microgramsto3mg–Volume:Dependsoncuvette-volumesrangefrom200microlitersto3mlorgreater–Accuracy:Fair–Convenience:Excellent,ifequipmentavailable–Majorinterferingagents:Detergents,nucleicacids,particulates,lipiddropletsAbsorbanceat205nm–Range:Roughly1to100micrograms–Volume:Dependsoncuvette-volumesrangefrom200microlitersto3mlorgreater–Accuracy:Fair–Convenience:Verygood–Majorinterferingagents:Detergents,nucleicacids,particulates,lipiddropletsColorimetricassaysModifiedLowry–Range:2to100micrograms–Volume:1ml(scaleupforlargercuvettes)–Accuracy:Good–Convenience:Fair–Majorinterferingagents:Strongacids,ammoniumsulfateBiuret–Range:1to10mg–Volume:5ml(scaledownforsmallercuvettes)–Accuracy:Good–Convenience:Good–Majorinterferingagents:AmmoniumsaltsBradfordassay–Range:1to20micrograms(microassay);20to200micrograms(macroassay)–Volume:1ml(micro);5.5ml(macro)–Accuracy:Good–Convenience:Excellent–Majorinterferingagents:None针对核酸的操作一般要注意的问题基本要求：尽量保持被分离核酸的完整性，除去影响下步操作的物物质。高分子量的DNA（核DNA）操作主要注意的是它易被机械切割力破坏RNA操作的主要障碍是“无处不在”的RNA酶的降解STORAGE：（储存）5oCisoneofthebestandsimplestconditionsforstoringDNA.-20oC:thistemperaturecausesextensivesingleanddoublestrandbreaks.-70oCisprobableexcellentforlong-termstorage.Forlong-termstorageofDNA,itisbesttostoreinhighsalt(1M)inthepresenceofhighEDTA(10mM)atpH8.5.StorageofDNAinbuoyantCsClwithethidiumbromideinthedarkat5oCisexcellent.Thereisaboutonephosphodiesterbreakper200kbofDNAperyear.StorageofDNAinthephageisbetterthanstoringthepureDNA.QUANTITATION.（定量）.ForpuresolutionsofDNA,thesimplestmethodofquantitationisreadingtheabsorbanceat260nmwhereanODof1ina1cmpathlength=50ug/mlfordouble-strandedDNA,40ug/mlforsingle-strandedDNAandRNAand20-33ug/mlforoligonucleotides.Anabsorbanceratioof260nmand280nmgivesanestimateofthepurityofthesolution.PureDNAandRNAsolutionshaveOD260/OD280valuesof1.8and2.0,respectively.ThismethodisnotusefulforsmallquantitiesofDNAorRNA(1ug/ml).RNA操作注意事项与实验技巧1.如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。2.操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。尽量避免使用抛弃式塑料手套。塑料手套不贴身，常常造成操作不便，而且多出部分还容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染处传递，扩大污染。3.尽量使用一次性枪头、离心管等塑料制品，尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。推荐使用出厂前已经灭菌的枪头和离心管，大多国外厂商供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染，买来后可直接用于RNA操作。许多研究者用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA酶，从而导致实验失败。4.配制溶液用的酒精，异丙醇、Tris等应采用未开封的新品。溶液需用DEPC水配制（加0.01%(体积比)DEPC至重蒸水或MiliQ级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水）5.所有玻璃制品都必须在240℃烘烤4小时。所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，并用DEPC-H2O彻底冲洗后灭菌，也可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。无法用DEPC处理的用具可以用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。样本保存的注意事项：样本一旦从生物体中分离后，细胞内的RNA就变得非常不稳定，容易降解。因此取样后，如何保证取样前后基因的表达模式不变，就变得非常重要。传统方法是用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。核酸提取分离纯化的基本操作碱裂解的原理：碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离目的。在碱性条件下，线性大分子细菌染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构