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1第六章一般毒性作用及其试验与评价方法一般毒性作用：是指毒物对动物机体产生的综合毒性效应，也称基本毒性作用根据接触毒物的时间长短可将产生的毒性作用分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。第一节急性毒性作用及其试验与评价方法一、急性毒性试验的概念急性毒性试验是指动物机体一次或24h内多次接触受试物后在短期内所产牛的毒性效应及反应。观察内容一般包括行为变化、外观改变以及致死效应。观察时间一般为7d，观察范围可为7～28d（迟发毒性效应）。凡经口或经注射给毒，“一次”的含义是指瞬间将受试物输入试验动物体内；若经呼吸或皮肤给毒，“一次”则指在一个特定的时间内，使试验动物持续接受受试物的过程。“24h内多次接触受试物”的概念是指当受试物毒性很低，一次接触还不能达到充分了解该受试物的毒性作用，或一次不能导入设计剂量的受试物时，需在24h内分次染毒。二、急性毒性试验的目的（1）测定和计算出受试物的致死量及其他急性毒试参数，主要获得受试物对某种实验动物以某种接触途径的LD50值；(2)了解受试物对动物机体的急性毒性特征，靶器官和剂量一反应关系；(3)研究受试物在动物体内的动力学变化规律；(4)为下一步的亚慢性、慢性毒性试验及其他毒理学试验的剂量设计和观察指标选择提供依据。三、急性毒性试验方法1．实验动物的选择和要求(1)品种、品系的选择实验动物选择的原则是以哺乳动物为主，选择两种或两种以上的动物，包括啮齿类(rodentspecies)和非啮齿类(nonrodenlspecies)，其中至少有一种非啮齿类动物。啮齿类多选用小鼠和大鼠，非啮齿类常选用犬或猴。(2)性别和年龄或体重的要求对于实验动物的性别一般要求雌雄(早6)各半。如果试验仅为某些特殊试验研究目标，也可选用单一性别。如致畸试验可仅选雌性动物，对精子毒性试验可仅选雄性动物。急性毒性试验通常要求刚成年的动物。一般按体重选购，通常要求小鼠18～25g、大鼠180～240g、豚鼠．200～250g、家兔2～2．5kg、猫1．5～2kg、犬4～6kg(犬一般为1岁左右)。同次试验小鼠体重相差不超过4g、大鼠体重相差不超过10g。一般来说，同一批次实验2动物体重变异范围不应超过其平均体重的20％。(3)实验动物数量与分组急性毒性试验一般要求设5～7组，每组的实验动物数依实验动物种类而定。一般大、小鼠每组不少于10只，家兔每组不少于8只，犬等大动物每组不少于6只。分组时应严格按照随机化的原则。(4)检疫和适应质量控制(包括品种、品系、遗传和微生物背景)。购回的实验动物在试验前应有1～2周的检疫观察和适应期。2．染毒方法静脉注射吸人肌肉注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射经皮。同一受试物不同染毒途径LD50。的大小通常也符合此规律。(1)经口染毒经口染毒常可采用灌胃、饲喂、吞咽胶囊等方式。各经口染毒方式各有优缺点，应视具体情况选用。①灌胃法：将受试物配成一定浓度的溶液或混悬液，经胃管或灌胃针一次导入胃内。灌胃容量视实验动物大小而定。小鼠，一次0．2～1mL或0．1～0．5mL／10g体重；大鼠，一次不超过5mL／只，或0．5～1．OmL／l00g体重；家兔，不超过10mL／2kg体重；狗，不超过50mL／10kg体重。染毒剂量、溶液浓度和灌胃体积之间可采取两种方式。一种方式为采用等体积不等浓度灌胃，另一种方式为采用等浓度不等体积灌胃。其关系可表示如下。等体积不等浓度灌胃：随各组剂量增加，溶液浓度加大，灌胃体积不变。等浓度不等体积灌胃：随各组剂量增加，溶液浓度不变，灌胃体积加大。灌胃法的优点是染毒剂量准确；缺点是工作量大，操作要求谨慎，一旦灌胃误人气管，即可人为导致动物死亡。②饲喂法：将受试物拌入饲料或饮水中，让其自由摄入。需单笼饲养动物，每天结算摄食量或饮水量，来折算摄入受试物的剂量。饲喂法的优点是简单易行，符合人类接触受试物的实际情况。但也有许多缺点，一方面是动物对受试物的摄入量不够准确，与设计剂量之间的误差较大：另一方面是动物可能拒食有异味或适口性差的受试物，使摄人量减少，这样，染毒量就达不到设计剂量，同时影响动物的正常摄食和生长发育。此外，易挥发物、易水解、易氧化等受试物会因挥发或变质而损失。③吞咽胶囊法：将受试物装入胶囊内，强行放于动物舌后咽部，迫使动物咽下。此法常用于兔、猫、犬、猴等较大动物的染毒。吞咽胶囊法的优点是剂量准确，尤其适用于易挥发，易水解、易氧化、有异味的受试物；3缺点是经口投放胶囊时动物有咬伤人的危险。需要注意的是：经口染毒前，实验动物应禁食一段时间。家兔、猫、犬、猴可在每日上午喂食前给予受试物，即空腹给药。大、小鼠一般采用染毒前隔夜禁食，给予受试物后应继续禁食3～4h。(2)经呼吸道染毒经呼吸道染毒主要用于评价以气体、蒸气、粉尘、烟雾等形式存在的有毒有害物质。呼吸道染毒方式分为吸人和气管内注入两种方式。吸入又分为静式和动式两种方式。按实验动物的最低需气量，小鼠为3．45L／h，大鼠为30．5L／h计算，一般50L染毒柜可放入小鼠6～10只，或大鼠1只，染毒2h。染毒柜体积、放置动物种类和数量及放置时间相互关系见表6—1。(3)经皮染毒用于评价经皮肤接触的外源性化学物，如化妆品、农药、外用药物、环境污染物及职业接触的一些工业毒物。染毒面积则依据选用动物及受试物的剂量和剂型而定。一般在动物背部脊柱两侧选定体表10％的面积，或家兔可取5cm×6cm，豚鼠取3×4cm，大鼠取1．5～2.0cm、小鼠取1．0～1．5cm直径的面积。经皮吸收染毒也可采用大鼠、小鼠浸尾染毒。(4)经注射途径染毒注射染毒途径有静脉注射(iv)、肌肉注射(im)、皮下注射(sc)、皮内注射(id)和腹腔注射(ip)等。3．剂量设计与分组(1)预试验的剂量设计①等比剂量设计一般设5～7组，各组问采用一定的公比设计剂量。预试验的各组剂量组距可拉大一些，如可用4倍公比。即公比r=4，则组距i=lg4=0．6。预试的目的是要得到死亡率在10％～90％之问的致死剂量范围，即受试物对实验动物以某种接触途径的10％～90％致死剂量范围。再根据后面介绍的正式试验剂量设计方法，计算正式试验组距(i)或正式试验公比(r)，进行正式试验剂量分组。关于预试验，对于无资料可参考的受试物，为节省试验动物用量，可用下述“多、快、好、省”的预试验方法。②3×3法动物均无死亡，说明剂量偏低，剂量可上移增大；4③序贯法(上下法)该法适于快速反应试验，简便，节约动物。方法是设计一系列等比系列剂量，将动物一只一只序贯进行。先选择一个接近50％反应的剂量，当第一只动物不死时，则用高一级剂量给予下一只动物；反之，第一只动物死亡，则用低一级剂量给予下一只动物。如此进行下去，可确定致死剂量范围。（2）正式试验的计量设计①计算组距或公式根据预试验结果，以下式计算正式试验组距(i)或正式试验的公比(r)。（a）正式试验组距（P127）（b）正式试验的公比②正式试验剂量分组正式试验剂量的公比r或组距i确定后，则可进行正式试验分组。分组结果见表6—4。正式试验一般分5～7组，每组动物数小鼠不少于10只，大鼠6～8只，家兔4～6只，雄雌各半。4.实验设计改良寇氏法（实验设计要求及LD50的计算）。P1275．急性毒性试验的观察内容(1)中毒出现的时间和症状染毒后4h内最密切注意观察，当天进行多次观察，以后每天注意观察。记录染毒后动物的异常表现和出现时间，对症状进行描述，总结受试物对实验动物的毒性特征。(2)死亡时间及死亡数观察记录各组动物死亡数和死亡时问。(3)剖检、生化及病理学检查对死亡动物及时解剖，观察记录受试物对实质脏器的损害，必要时采取标本做病理组织学检查，初步确定靶器官，为进一步的靶器官确定和毒作用机制分析提供方向。有些急性毒性试验也要设计一些生化检测指标。(4)毒代动力学分析这是专门的毒代动力学研究而进行的工作。按毒代动力学的给毒、采样、分析、建模及参数计算设计试验和分析。具体原理和方法见本书第四章。观察内容较为单纯，只做死亡记录和毒性特征观察即可。若同时要为下一步的毒理机制研究鉴定基础，就需进行剖检、生化及病理学检查。四、急性毒性的分级与评价四．急性毒性分级和评价1、急性毒性分级对于不同类型毒物分级标准稍有差异。农药使用四级分级标准，工业毒物常用五级分级标我国食品毒理学则采用国际六级分级标准。各类毒物急性毒性分级标准见表6—8～表56-11。毒性危险性分级见表6—12。2．急性毒性评价1）如果剂量达10g／kg体重以上，仍不引起死亡者，可认为该受试物急性毒性试验是安全的，不必测定其LD50；2）如果急性毒性LD50或7d在喂养试验的最小有作用剂量小于人的可能摄入量的10倍者，则表明该化合物急性毒性较大，应予以放弃，不再继续试验：如急性毒性LD，。大于人可能摄入量的10倍者，该物质有可被使用的希望。3）尽可能详尽描述中毒特征、症状表现、出现时间、死亡前兆、毒性作用的发生、发展、恢复经过，以及体重、剖检和病理学变化等。从而较全面地对急性毒性做出评价。第二节亚慢、性毒性作用及其试验与评价方法一、亚慢性毒性试验的概念亚慢性毒性试验：是指实验动物连续多日接触较大剂量外来化合物所引起的毒性作用。试验期通常为3～6个月，或一般为实验动物生命期的1／10～1／30。如用小鼠，试验期通常为3个月，大鼠3～6个月，狗4～12个月。二、亚慢性毒性试验的目的(1)进一步探索受试物的毒作用特点和靶器官；(2)了解受试物有无蓄积作用，是否产生耐受性；(3)分析受试物的剂量一效应关系；(4)初步估计出不出现毒性作用的最大耐受量(即最大无作用剂量NOEL，或称未观察到损害作用剂量NOAEL)和出现毒性的最小有作用剂量(即MED，也称最低观察到损害作用的剂量LOAEL)；(5)为慢性毒性试验的剂量设计和观察指标提供依据；(6)为受试物的毒理机制研究提供基础资料。三、亚慢性毒性试验方法1．试验动物的选择和要求(1)品种、品系的选择一般要求选择两种以上的实验动物，包括啮齿类和非啮齿类动物。常用动物有小白鼠、大白鼠、犬、猫，也有家兔。对于重要的受试物甚至可选用灵长类动物猴。小白鼠品系常选用昆明种、NIH或IcR；大白鼠品系常选用wistar和sD；犬的品系常选用Beagle大。(2)性别和年龄的要求对试验动物的性别要求一般为雌雄各半。为了某种特殊试验目的可选用单一性别。6年龄选择的一般原则是离乳不久的动物。一般以体重为标准，小鼠为15～18g，大白鼠50～100g(6～8周龄)，猫1～2kg。同组实验动物体重相差不应超过平均体重的10％，组间平均体重相差不超过5％。(3)实验动物数量实验动物数量，小动物每组一般不少于20只；较大动物每组一般为6～10只，不少于6只，如犬、猴每组不少于6只。若试验过程需处死动物，则每组动物数要相应增加。(4)检疫和适应2．染毒方法亚慢性毒性试验染毒方法选择的原则是：尽量选择和人类接触途径相似的方式。食品毒理试验一般以经口染毒为主，多采用饲喂法，每日染毒，连续给予。试验期间，每日定时定量染毒，称量当日给食量和次日结余量，结算每日摄入量，自由饮水。采用饲喂法时，保证受试物在饲料中混匀，并应有在饲料中稳定性的资料和相应措施。对于有异味、易挥发、易水解、易氧化等受试物，可采用灌胃或胶囊吞咽法。3．剂量设计与分组(1)试验设组亚慢性毒性试验一般至少应设4个组，分别为高剂量、中剂量、低剂量3个剂量组和1个空个对照组(阴性对照)。(2)剂量设计亚慢性毒性试验剂量设计至关重要，直接关系到试验的成败。①剂量设计的原则剂量设计的原则是：高剂量组尽量控制为受试动物在整个试验期内既不发生死亡，又能引起明显的毒性反应，或仅有个别动物死亡，但死亡率不超过10％；低剂量组应无中毒反应，相当于未观察到损害作用剂量(NOAEL)；中剂量组较理想的设计应相当于观察到最小损害作用剂量LOAEL)。②剂量设计的依据高剂量组：通常以急性毒性试验的阈剂量作为亚慢性毒性试验的最高剂量，或以该受试物LD50的1／20～1／5为最高剂量。中、低剂量组：高剂量确定之后，一般以3～10