第8章 球菌

1第8章球菌球菌（coccus）是细菌中的一个大类。对人类有致病性的病原性球菌（pathogeniccoccus）主要引起化脓性炎症，故又称为化脓性球菌（pyogeniccoccus）。根据革兰染色性的不同，分成革兰阳性和革兰阴性两类。前者有葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌等；后者有脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。第一节葡萄球菌属葡萄球菌属（Staphylococcus）的细菌是一群革兰阳性球菌，常堆聚成葡萄串状。广泛分布于自然界，例如空气、水、土壤、物品以及人和动物的皮肤及与外界相通的腔道中。大部分是不致病的腐物寄生菌。有些人的皮肤和鼻咽部可带有致病菌株，一般鼻咽部带菌率为20%~50%，医务人员的带菌率可高达70%以上，是医院内交叉感染的重要传染源。葡萄球菌能引起皮肤粘膜、多种组织器官的化脓性炎症，是最常见的化脓性球菌。此外，金黄色葡萄球菌耐药菌株高达90%以上，由该菌所致的败血症或脓毒血症仍占居首位。葡萄球菌有的菌株还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征、毒性休克综合征等疾病。一、生物学性状形态与染色球形或略呈椭圆形。直径0.5~1.5m，平均0.8m。典型的葡萄球菌排列呈葡萄串状，此因在繁殖时向多个平面不规则分裂所致（图8-1）。固体培养基上生长的细菌形态，一般常呈典型排列；在脓汁或液体培养基中生长者，常为双球或短链状。葡萄球菌无鞭毛，无芽胞，体外培养时一般不形成荚膜。易被常用的碱性染料着色，革兰染色为阳性。当衰老、死亡或被中性粒细胞吞噬后的菌体常转为革兰阴性。图8-1培养特性营养要求不高，在普通基础培养基上生长良好；在含有血液或葡萄糖的培养基中，生长更为繁茂。兼性厌氧或需氧。最适生长温度为37℃。最适pH为7.4。在肉汤培养基中经37℃孵育24h，呈均匀混浊生长，管底稍有沉淀。在普通琼脂平板上孵育24~48h后，形成圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明的菌落。直径在2mm左右。菌落因种不同而出现金黄色、白色或柠檬色等色素。该色素属胡萝卜素类，脂溶性，故培养基不着染。在血琼脂平板上，有的菌株菌落周围形成明显的全透明溶血环（溶血），溶血菌株大多有致病性。致病性菌株在20%~30%CO2的气体中孵育，产生毒素最佳。生化反应触酶阳性。多数菌株能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产气。致病株能分解甘露醇。抗原构造已发现的抗原在30种以上，其化学组成和生物学活性了解的仅少数。1．葡萄球菌A蛋白（staphylococcalproteinA,SPA）存在于菌细胞壁的一种表面蛋白。2SPA是一种单链多肽，与胞壁肽聚糖呈共价结合。90%以上的金黄色葡萄球菌菌株有此抗原，所有人源菌株均有，但不同株间含量相差悬殊。有人推算CowanI株每个菌表面可有80000个SPA分子。SPA可与人类IgG1、IgG2和IgG4的Fc段非特异性结合，亦能同豚鼠、小鼠等多种哺乳动物的IgGFc段结合；而IgG分子的Fab段仍能同相应抗原分子发生特异性结合。采用含SPA的葡萄球菌作为载体，结合特异性抗体后，可开展简易、快速的协同凝集试验（coagglutination），广泛应用于多种微生物抗原的检出。SPA与IgG结合后的复合物具有抗吞噬、促细胞分裂、引起超敏反应、损伤血小板等多种生物学活性。2．荚膜宿主体内的大多数金黄色葡萄球菌表面存在着荚膜多糖，有利于细菌粘附到细胞或生物合成材料表面（如生物性瓣膜、导管、人工关节等）。3．多糖抗原具有群特异性，存在于细胞壁。A群多糖抗原从金黄色葡萄球菌中提出，化学组成为磷壁酸中的N-乙酰葡糖胺核糖醇残基。B群多糖抗原分离自表皮葡萄球菌，化学组成是磷壁酸中的N-乙酰葡糖胺甘油残基。分类根据DNA的相关性程度，葡萄球菌属可分为32种。若根据色素、生化反应等不同表型，葡萄球菌可分为金黄色葡萄球菌（S.aureus）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）和腐生葡萄球菌（S.sarophyticus）3种。其中金黄色葡萄球菌多为致病菌，表皮葡萄球菌偶可致病，腐生葡萄球菌一般不致病。此外，根据有无凝固酶，也可将葡萄球菌分为凝固酶阳性菌株和凝固酶阴性菌株两大类。过去认为凝固酶阳性株有致病性，阴性株不致病；但近年来发现后者亦可致病。三种葡萄球菌的主要生物学性状见表8-1。表8-1三种葡萄球菌的主要性状性状金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌菌落色素金黄色白色白色或柠檬色凝固酶+－－葡萄糖++－甘露醇+－－溶血素+－－耐热核酸酶+－－A蛋白+－－磷壁酸类型核糖醇型甘油型两者兼有噬菌体分型多数能不能不能致病性强弱无凝固酶阳性的葡萄球菌可被相应的噬菌体裂解，目前可分为4个噬菌体群和23个噬菌体型。葡萄球菌肠毒素食物中毒主要由III群菌株引起；II群菌株耐药性的出现常慢于I、III群；I群中的52、52A、80、81型菌株常是医院中严重败血症的流行株；产生表皮剥脱毒素的主要属于噬菌体II群71型菌株。因此，葡萄球菌的噬菌体分型在流行病学调查时追查传染源和研究菌型与疾病类型间的关系均有重要作用。随着分子生物学技术的发展，出现了DNA分析的遗传学方法。传统的金黄色葡萄球菌的分析方法已逐步被DNA基因型方法取代，如染色体DNA的脉冲电泳分型法、随意引物PCR法等，其特异性比表型分类法更高。抵抗力葡萄球菌对外界因素的抵抗力强于其他无芽胞菌。干燥脓汁、痰液中存活2~33月；加热60℃1h或80℃30min才被杀死；2%石炭酸中15min或1%升汞水中10min死亡；耐盐性强，在含10%~15%NaCl的培养基中仍能生长。同其他革兰阳性菌一样，对碱性染料敏感，例如1:100000~200000的龙胆紫溶液可抑制其生长。近年来由于广泛应用抗生素，耐药菌株迅速增多，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantS.aureus,MRSA）已经成为医院内感染最常见的致病菌。二、致病性致病物质金黄色葡萄球菌产生的毒素及酶最多，故其毒力最强。表皮葡萄球菌则较少、较弱，一般不致病，在特殊情况下可成为条件致病菌。葡萄球菌的毒力因子包括：①酶：凝固酶、纤维蛋白溶酶、耐热核酸酶、透明质酸酶、脂酶等；②毒素：细胞毒素（、、、、杀白细胞素）、表皮剥脱毒素、毒性休克综合征毒素-1、肠毒素等；③其他：粘附素、荚膜、胞壁肽聚糖等。1．凝固酶（coagulase）是能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质。致病株大多数能产生，故凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。凝固酶有两种：一种是分泌至菌体外的蛋白质称为游离凝固酶（freecoagulase）。作用类似凝血酶原物质，被人或兔血浆中的协同因子(cofactor)激活为凝血酶样物质后，使液态的纤维蛋白原变成固态的纤维蛋白，从而血浆凝固。另一种结合于菌体表面并不释放，称为结合凝固酶(boundcoagulase)或凝聚因子（clumpingfactor）。其作用是在该菌株的表面有纤维蛋白原受体，当菌混悬于人或兔血浆时，纤维蛋白原与菌受体交联而使细菌凝聚。游离凝固酶采用试管法检测，结合凝固酶则以玻片法测定。凝固酶耐热，粗制品加热至100℃经30min或高压灭菌后仍保持部分活性；但易被蛋白酶分解破坏。凝固酶和葡萄球菌的致病力关系密切。凝固酶阳性株进入机体后，使周围血液或血浆中的纤维蛋白等沉积于菌体表面，阻碍体内吞噬细胞的吞噬；即使被吞，也不易被杀死。同时，凝固酶集聚在细菌四周，亦能保护病菌不受血清中杀菌物质的破坏。葡萄球菌引起的感染易于局限化和形成血栓，也与凝固酶的生成有关。2．葡萄球菌溶素（staphylolysin）致病性葡萄球菌能产生多种溶素，是损伤细胞膜的毒素。按抗原性不同，可分为、、、等，对人类有致病作用的主要是溶素。溶素是一类分子量不均一的蛋白质，分子量21~50kDa。不耐热，65℃30min被破坏。生物学活性较广泛，对多种哺乳动物红细胞有溶血作用，以兔红细胞最敏感，比人红细胞高约100倍。对白细胞、血小板、肝细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞等均有损伤作用。给兔皮下注射，引起皮肤坏死；静脉注射则导致死亡。溶素是一种外毒素，具有良好的抗原性；经甲醛液脱毒后可制成类毒素。3．杀白细胞素（leukocidin）大多致病性葡萄球菌能产生另一种破坏白细胞蛋白质称为Panton-Valentine(PV)杀白细胞素。PV杀白细胞素只攻击中性粒细胞和巨噬细胞，其作用部位主要在白细胞的细胞膜。先是细胞膜中三磷酸肌醇发生构型变化，膜穿孔后通透性增高，K+丢失。表现为白细胞运动能力丧失，胞内颗粒排出，细胞死亡。按PV杀白细胞素在羧甲基纤维素柱上相对移动速度不同，分为快（F）和慢（S）两种组分；当两者各自单独存在时，并无杀伤活性，必须协同才有作用。PV杀白细胞素在抵抗宿主吞噬细胞，增强病菌侵袭力方面有意义。44．肠毒素（enterotoxin）约1/3临床分离的金黄色葡萄球菌可产生肠毒素。按抗原性和等电点不同，分A、B、C1、C2、C3、D、E、G和H9个血清型，均能引起急性胃肠炎即食物中毒，与产毒菌株污染了牛奶、肉类等食物有关。以A、D型多见，B、C型次之。同一菌株能产生两型或以上的肠毒素，但常以一种类型的毒素为主。产肠毒素的菌株常是凝固酶阳性株，不过耐热核酸酶和肠毒素两者的存在更为平行。葡萄球菌肠毒素是一组热稳定的单纯蛋白质，分子量26~30kDa。耐热100℃30min；抵抗胃肠液中蛋白酶的水解作用。葡萄球菌肠毒素对人的中毒剂量报道不一，一般认为约1g/kg。其作用机制可能是到达中枢神经系统后刺激呕吐中枢而导致以呕吐为主要症状的食物中毒。此外它还具有超抗原作用。5．表皮剥脱毒素（exfoliativetoxin,exfoliatin）也称表皮溶解毒素（epidemolytictoxin），主要由噬菌体II群金黄色葡萄球菌产生。蛋白质性质，分子量24~33kDa，等电点为7.0。具有抗原性，可被甲醛液脱毒成类毒素。有两个血清型：A型耐热，100℃20min不被破坏，40min始灭活；B型不耐热，60℃30min即破坏。表皮剥脱毒素引起的烫伤样皮肤综合征（staphylococcalscaldedskinsyndrome,SSSS），又称剥脱性皮炎，多见于新生儿、幼儿和免疫功能低下的成人。患者皮肤呈弥漫性红斑和水疱形成，继以表皮上层大片脱落，受损部位的炎症反应轻微。6．毒性休克综合征毒素-1（toxicshocksyndrometoxin1,TSST-1）由噬菌体I群金黄色葡萄球菌产生的一类蛋白质。TSST-1可引起机体发热，增加对内毒素的敏感性。感染产毒菌株后可引起机体多个器官系统的功能紊乱或毒性休克综合征（TSS）。过去TSS多见于使用月经阴道塞的妇女，但近年来发现许多病例与月经无关，由TSST-1引起的TSS病例只占75%左右。据此有学者认为TSST-1不是引起TSS的唯一病因，革兰阴性杆菌内毒素、葡萄球菌肠毒素和溶血素等与TSS的发病也有密切的关系。TSST-1的蛋白质密码序列长度为585个碱基对（194个氨基酸），据此推测其分子量为22049，此与经SDS-PAGE测定的TSST-1分子量22000极为接近。TSST-1经木瓜蛋白酶分解，可产生分子量分别为16.3、12.4和9.7kDa三个片段。前两片段具有血清学和生物学活性，后一片段无活性。从临床分离的金黄色葡萄球菌菌株，仅20%左右能产生TSST-1。遗传学研究表明TSST-1基因(tst)位于染色体上。7、其他(1)纤维蛋白溶酶（fibrinolysin）：亦称葡激酶（staphylokinase）。可激活血浆中的纤维蛋白酶原，使之成为纤维蛋白酶，导致血浆纤维蛋白的溶解，利于病菌的扩散。(2)耐热核酸酶（heat-stablenuclease）：致病性葡萄球菌能产生该酶。耐热，经100℃15min或60℃2h不被破坏；能较强的降解DNA和RNA。目前临床上已将耐热核酸酶作为测定葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。(3)透明质酸酶（hyaluronidase）：亦称扩散因子（sp