生活饮用水微生物指标检验

生活饮用水微生物指标检验•检测依据：GB5750-2006《生活饮用水卫生检验规范》实验目的与要求–掌握水样采集规则及注意事项。–熟悉常用水卫生细菌学指标。–熟悉菌落总数、大肠菌群、耐热大肠菌群的测定方法及检测意义。–学会对所检测的水样作综合分析。生活饮用水中微生物指标项目单位限值说明总大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出一般性污染耐热大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染大肠埃希氏菌MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染菌落总数CFU/mL100一般性污染贾第鞭毛虫个/10L1肠道原虫隐孢子虫个/10L1肠道原虫水微生物检测的意义•水体的微生物污染问题日趋严重。–在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，适于各种微生物的生长。–水体中微生物污染的来源：土壤，以及人类、动物的排泄物污染。–水体中少数致病微生物（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。•水微生物检测可用于评价水质情况，预报水质的污染趋势，以保证水质的卫生安全。•在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对水体中各种可能存在的致病微生物一一进行检测。•一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌，通过对指示菌的检测，来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。水微生物的检测指标•菌落总数(aerobicbacterialcount)–是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经48h培养后，所生长的细菌菌落的总数。–检测意义：作为一般性污染的指标，即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但不能说明污染的来源。水质微生物的检测指标•总大肠菌群(coliformbacteria)–是指一群需氧及兼性厌氧的，37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。–检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。耐热大肠菌群耐热大肠菌群（thermotoletantColiformOrganisms）：在44～44.5℃下具有与大肠菌群相同发酵及生物化学性能的菌群。注意：我国习惯上把耐热大肠菌群称为“粪大肠菌群”。实验内容–水样采集；–菌落总数的测定；–总大肠菌群的测定;–耐热大肠菌群的测定。微生物指标常规检验流程水样总大肠菌群菌落总数报告报告耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌报告一、水样采集水样采集•采样原则–所采集的样品具有代表性。–采样容器：选择无菌硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。•不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待测组分；不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间，样品各组分的浓度不发生改变。–微生物样品必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证在运送、贮存过程中不受污染。水样采集•自来水水样：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min（经常用水的水龙头放水1～3min）后，采集水样于无菌玻璃瓶，约占瓶容量80%，以便摇匀水样。•水源水水样：选有代表性的地点及可疑地方，一般距水面下10～15cm采样。采样后，将瓶塞盖好，再从水中取出。水样采集•注意事项–严格无菌操作。–做好标记：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等内容。–从速送检。水样从采集到检验不应超过2h，在4℃下保存不应超过24h。实验前准备1、灭菌吸管10mL、1mL刻度吸管分别包好，160℃干烤2h灭菌2、9mL灭菌生理盐水3、相应的灭菌培养基4、检验前，无菌室及超净台用紫外线灯照射30min菌落总数•定义：•是指水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1mL水样所含细菌菌落的总数。•培养基：•营养琼脂•设备：•放大镜/菌落计数器菌落总数平板计数法1mL饮用水水样平皿1mL水源水水样10倍系列稀释50℃营养琼脂36±1℃培养48h计数平行样空白样菌落总数平板计数法–[方法]•水样摇匀20次左右，使细菌分散。•倾注培养：无菌吸取1ml水样分别置于2个空平皿，另一个作空白对照。再倾注15ml琼脂（约45℃）于平皿中旋转，混匀待琼脂凝固后倒置37℃48h。•菌落计数：用肉眼或放大镜检查，计数平皿内菌落数目。菌落总数平板计数法•[结果分析与报告]–计算平均菌落数：–报告方式：菌落总数(cfu/ml)。cfu：colonyformingunits•当检样的菌落数为l~100时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字报告。–国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。（二）水源水•[器材与试剂]–无菌1ml吸管6支/组，无菌10ml吸管1支/组。–无菌平皿9个/组，营养琼脂。–90ml灭菌盐水1瓶（内置适量玻璃珠），9ml灭菌盐水管3支。•[方法]–稀释水样：•无菌吸10ml混匀水样注入90ml灭菌水瓶中,混匀成1:10水样。•取1:10水样1ml注入9ml灭菌试管中混匀成1:100水样。同法稀释成1:1000,1:10000水样。•[方法]–倾注培养：•用1ml无菌吸管吸取2~3个适当浓度的稀释液1ml,分别注入无菌平皿中，每个稀释度应同时做2个平皿，另取一平皿作空白对照。再做倾注培养(方法同饮用水)。–菌落计数：方法同饮用水。菌落总数测定•[结果分析与报告]–计算不同稀释度的平均菌落数：–稀释度的选择和菌落总数报告方式：•首先选择平均菌落在30～300之间者进行计算。•计算方法和报告方式如表1所示。菌落总数平板计数法表1稀释度选择及菌落总数报告方式例次不同稀释度的平均菌落数两稀释度菌落总数之比菌落总数(cfu／m1)报告方式(cfu／m1)10-110-210-312345678136527602890150多不可计27多不可计01642952713046501l305020466085135120—1.62.22————1640037750271001500513000270305001×1016000或1.6×10438000或3.8×10427000或2.7×1041500或1.5×103510000或5.1×105270或2.7×10231000或3.1×10410•由表2可判定水质被污染的程度。表2一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系水的类别最清洁水清洁水不太清洁水不清洁水极不清洁水菌落总数cfu／m110~100100~10001000~1000010000~100000＞100000[注意事项]–菌落总数测定中，应选择合适的稀释度进行。（生活饮用水，国家标准规定每毫升不得超过100个，因此可以直接吸取1毫升到平板进行培养）–各稀释管、相应平皿做好标记。包括：水样名称、稀释度、时间、小组。–严格无菌操作。进行水样稀释时，每一稀释度均需更换吸管。–倾注时，要注意营养琼脂的温度。–倾入琼脂后要混匀，待琼脂凝固后倒置培养。三、总大肠菌群的测定—多管发酵法分为三步：•初发酵试验•平板分离•复发酵证实试验多管发酵法•定义：•总大肠菌群指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。•培养基：•乳糖蛋白胨培养液•二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液•伊红美蓝培养基•设备：•显微镜二倍乳糖蛋白胨培养液×5管乳糖蛋白胨培养液×5管乳糖蛋白胨培养液×5管10mL1mL1mL水样10倍稀释阴性报告未检出阳性EMB36±1℃培养24h36±1℃培养24h革兰氏染色显微镜检报告阴性无典型菌落无典型细菌报告阴性G-无芽孢杆菌乳糖蛋白胨培养液36±1℃培养24h无产酸产气报告阴性阳性MPN表结果报告乳糖发酵试验24h分离培养24h证实试验24h15管法检测步骤•初发酵试验：采用乳糖蛋白胨培养液37℃培养24h，观察产酸产气情况。•平板分离：对阳性管培养物，接种于伊红美蓝培养基，观察菌落特征，并进行革兰氏染色和镜检。•复发酵证实试验：对典型和可疑菌落，接种于乳糖蛋白胨培养液，进行复发酵证实试验.，•结果报告（MPN）：根据标准所附检索表报告结果（MPN—”最可能数”）。产气初发酵、复发酵试验结果多管发酵法结果大肠菌群在伊红美蓝培养基上的典型菌落特征大肠菌群革兰氏染色显微镜下的形态耐热大肠菌群•多管发酵法•耐热大肠菌群（thermotoletantColiformOrganisms）：在44～44.5℃下具有与大肠菌群相同发酵及生物化学性能的菌群。耐热大肠菌群的测定1.1基本性质培养温度提高到44～44.5℃，在此条件下仍能生长和发酵乳糖的菌群。埃希氏菌属：粪源特异性耐热大肠菌群克雷伯菌属肠杆菌属总大肠菌群柠檬酸菌属其它(阴沟肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌)注意：耐热大肠菌在配水系统中是不能繁殖的，除非管网中有充足的营养物质（升华需氧量超过10/mgL）,以及管网中没有余氯。耐热大肠菌群的测定1.2主要用途埃希氏大肠菌是最准确和专一的粪便污染指示。耐热大肠菌的检出，可认为近期水体直接或者间接地受到了粪便污染。注意：GB/5749-2006规定，如果饮用水检出总大肠菌群，就必须检测耐热大肠菌或者埃希氏大肠菌。多管发酵法•定义：用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。•培养基：1.EC培养基2.伊红美蓝琼脂•设备：•无特殊设备检测步骤•初发酵（同总大肠菌群），24h•耐热培养：阳性管接种（44.5度），24h•平板培养：阳性管接种EMB平板，24h乳糖蛋白胨培养液×5管乳糖蛋白胨培养液×5管二倍乳糖蛋白胨培养液×5管10mL1mL1mL水样10倍稀释阴性报告未检出阳性EMB36±1℃培养24h36±1℃培养24h报告阴性结果报告乳糖发酵试验24h证实试验24h多管发酵法检测步骤EC培养液44.5℃培养24h不产气产气有典型菌落检索MPN表耐热培养24h无典型菌落报告阴性微生物指标检验方法的总结菌落总数细菌学指标总大肠菌群耐热大肠菌群大肠埃希氏菌平板计数法多管发酵法滤膜法酶底物法多管发酵法滤膜法多管发酵法滤膜法酶底物法检验日程安排–前一日：实验准备、采水瓶、培养基配制、灭菌–采水当日：水样采集、倾注培养、初发酵试验。–第二日：阳性管—EMB平板分离+EC肉汤。–第三日：涂片+革兰氏染色镜检、复发酵试验；EC阳性转EMB平板。菌落计数及结果报告。–第四日：报告总大肠菌群MPN和耐热大肠菌群MPN。完成原始记录，并对所检测的水样进行综合分析，发检验报告。