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生物化工创新实验指导目录实验室规范………………………………………………………1安全规范…………………………………………………………2第一章实验室啤酒发酵概论…………………………4第二章啤酒质量检测……………………………………6第一节酵母计数………………………………………6第二节酵母质量检测……………………………………7第三节斐林试剂法测定还原糖…………………………8第四节α-氨基氮测定……………………………………10第五节酒精度测定………………………………………12第六节双乙酰测定………………………………………131生物实验室须知一、实验室规范1.实验室中应穿实验服，以避免受药品侵蚀或其它污染。2.在实验室中不可饮食抽烟，上课时保持安静。实验课应按组别入座，不可任意变更座位。3.未经允许不得动用实验室中之仪器与药品或私自进行未经教师许可之实验，须在教师讲解后才可操作。4.凡各种废弃物应按规定方式丢弃，实验后之药品、溶液应倒入指定容器，不可任意倒入水槽。5.实验完毕后应将仪器归位，器械清洗干净、熄灭灯火，关闭自来水，清理桌面后方得离去。每次实验完毕，值日组应负责清扫实验室。6.实验室内各种实验的样品及微生物培养，皆不可任意携出实验室。7.实验室内禁止用口吸取微生物样品，禁止擅自带走实验室药品。8.在操作过程的开始前及终止后，双手都必须以药皂与70%的酒精水溶液清洗。9.微生物实验内，任何微生物的样品、废弃物(对具感染性的废弃物应特别注意)都必须高温高压灭菌后，才能以一般垃圾处理。2二、安全守则1.许多实验用药品会对身体造成伤害，因此应避免身体肌肤直接与药品接触、尽量避免吸入挥发性气体，实验完毕后彻底洗手。2.酒精灯在添加酒精时应先将火焰熄灭，酒精添加不可过满。引燃酒精灯时应使用打火机，而不可用另一酒精灯引燃。3.玻璃器皿的破碎常造成割伤，因此打破的玻璃不要以手捡取，清洗玻璃器皿时最好戴上手套。4.仪器与桌面保持清洁，若有强酸或其它腐蚀性药品流出应立即用水加以清洗。5.取用药品时务必注意药品名称、浓度是否符合实验所需，以避免误用造成危险。6.挥发性溶剂萃取、强酸取样、有毒物质应在排气柜内操作，始终保持室内通风。7.严禁在实验室水槽中排放腐蚀及剧毒溶液，倾倒少量废液必须用大量水冲洗。8.若发现一切可能不安全因素，请立即汇报实验室老师，尽早消除隐患。3第一章实验室啤酒发酵概论啤酒是一种以麦芽和水为主要原料，加啤酒花经发酵酿造而成的含有二氧化碳的低酒精度发酵酒。自从1900年俄罗斯商人在哈尔滨创建我国第一家啤酒厂后，到2003年，我国已发展成世界第一大啤酒生产国。啤酒的酿造工艺为：麦芽→粉碎→糖化→麦汁过滤→煮沸→冷却→发酵→过滤→除菌→贴标→装箱啤酒的酿造必须制备麦芽汁，然后冷却的麦汁中接种酵母，进行啤酒主发酵，发酵周期大约为1星期，发酵液糖度由10－12°下降到4°，然后在0－2°的密闭罐中进行后发酵，啤酒才可成熟。一、麦汁准备（协定法糖化）1）100g麦芽经粉碎机粉碎，并加入准确称量的糖化杯中，加入50g麦芽粉与46－47℃水400ml，充分搅拌，45℃保温30min;2)将醪液升温加热，以每分钟提高1℃的速度在25min内使醪液温度上升至70℃，并加入100ml70℃水；3）醪液于70℃保温大约1小时（至糖化完全），10－15min内急速冷却到室温（测定糖化时间）；4）擦干糖化杯，准确称量其内容物并补水至900g；5）过滤收集100ml滤液，复滤；6）测定滤液的糖度（糖度计）；发酵培养基调节糖度到10°P7）将滤液分装灭菌：将50ml滤液装入100ml三角瓶中灭菌，其余滤液装入1000ml三角瓶中，并加入1g啤酒花，煮沸42、将斜面酵母菌种全部接入50ml麦汁三角瓶中，25℃培养，并不时摇动；3、培养15-16小时，将50ml酵母种子接入到100ml麦汁三角瓶中，充分摇动，并于室温静止培养（大约10℃）；二、啤酒发酵扩大培养按照协定法糖化方法，称取麦芽1000g，糖化定容至9L，并收集滤液（使用纱布过滤），降温至室温并接种酵母菌，充分摇匀，静止培养；于培养第三天开始测定与啤酒发酵相关的参数，参数如下：1)酵母质量检查（出芽率，死亡率，血球计数板计数）2)还原糖α－氨基氮测定3)酒精度；4)双乙酰含量；5)苦味质与CO2含量5第二章啤酒质量检测第一节酵母计数酵母计数采用血球板计数法一、实验器材显微镜、血球计数板、盖玻片二、实验步骤（1）取洁净计数板一块，平放于桌面上，在计数室上方加盖玻片（2）取除气发酵液一小滴，滴至盖玻片的边缘，使菌液自然渗入计数室内（计数室内不能留有气泡）（3）静置4-5min，使酵母细胞稳定附着于计数室内（4）在显微镜下观察酵母菌数（5）酵母菌数的计算6第二节酵母质量检测一、实验原理酵母的质量直接决定到啤酒的好坏，酵母活力强，发酵就旺盛，否则啤酒即会变质，因此必须检测酵母的状态。二、实验器材1.器材：显微镜、恒温水浴、温箱、灭菌锅、三角瓶2.试剂：0.025％美蓝水溶液：0.025g美蓝溶于100ml水中pH4.5醋酸缓冲液：0.51g硫酸钙，0.68g硫酸钠，0.405g冰醋酸溶解于100ml水中三、实验步骤1.显微镜检测菌体形态：挑取少量菌液，加盖玻片，在高倍镜下观察，优良酵母形态均匀、表面光滑，细胞质透明均匀；老熟的细胞出现液泡，颗粒性储藏物多，折光率强。2.死亡率检测：酵母用美蓝水溶液染色后，由于活细胞具有脱氢酶活性，可将蓝色的美蓝还原成无色的美蓝，因此染不上颜色，而死细胞则被染上蓝色3.出芽率检测：出芽率是指出芽的酵母细胞占总酵母细胞数的比例，选择5个视野，观察出芽酵母细胞所占的比例并求取平均值（一般对数生长期的酵母出芽率60%）7第三节斐林试剂法测定还原糖一、实验原理CuSO4与NaOH反应生成蓝色Cu(OH)2沉淀，Cu(OH)2与酒石酸钾生成可溶性的蓝色络合物，此络合物中的Cu为＋2价，为氧化态形式，还原糖能够将Cu2＋还原成CuO红色沉淀，但是CuO沉淀的终点颜色变化较难确定，将氧化性较低的1％的美蓝作为指示剂更容易判断反应的终点，因此加入美蓝后，Cu2＋被完全还原后，美蓝就会被还原糖还原为无色的美蓝，因此，可通过此方法测定还原糖的浓度。二、实验器材与试剂1、器材：电炉、碱式滴定管2、实验试剂：（1）斐林试剂甲液：称取3.4639g结晶硫酸铜，溶于50ml水中，如有沉淀须过滤乙液：称取17.3g酒石酸钾，5gNaOH，溶于50ml水中（甲、乙溶液分别保存）（2）0.2％标准葡萄糖溶液：准确称量105℃烘干至恒重的分析纯葡萄糖0.500g，水溶解后加入2.5ml浓盐酸，定容至250ml；（3）1％亚甲基蓝指示剂：0.5g美蓝溶于50ml蒸馏水中三、实验步骤81、斐林试剂的标定：由于试剂纯度差异、称量定容时的误差，所配置的斐林试剂氧化能力有差异，因此需要对斐林试剂进行校准，配置准确时，甲、乙液各5ml可氧化25ml0.2％的葡萄糖溶液1)预滴定：准确吸取甲、乙溶液各5ml，放入250ml三角瓶中，加入水约20ml，并从滴定管中加入约24ml0.2％标准葡萄糖溶液，将三角瓶在电炉上加热煮沸，维持2min，加入1％亚甲基蓝指示剂2滴，在沸腾状态下以每秒1滴的速度滴入0.2％标准葡萄糖溶液，至溶液蓝色变为鲜红色为止（滴定操作在1min内完成）记录总耗糖量V；2)正式滴定：步骤如上，用(V－1)ml标准葡萄糖代替24ml葡萄糖溶液，最后在1min内完成滴定，记录消耗总葡萄糖量V1；3)斐林试剂校正系数F=CV1/F0（F0可查）2.样品滴定：1)稀释：样品除气过滤后，稀释（麦汁稀释20倍，啤酒主发酵期稀释10倍）2)滴定：以样品代替标准葡萄糖溶液（需预滴定与滴定）3)计算：G：麦汁中浸出物含量百分数D：麦汁20度时的相对密度9第四节α-氨基氮测定一、实验原理：啤酒中的α-氨基占氨基酸总量的绝大部分，α-氨基可被茚三酮氧化脱羧成为减少一个碳的醛，并释放出氨气和二氧化碳，而水合茚三酮本身被还原成还原型水合茚三酮，还原型水合茚三酮与未还原的茚三酮及氨反应生成蓝紫色羧合物，颜色与游离氨基成正比，在570nm下比色检测。二、实验器材与试剂：（1）器材：分光光度计，电炉，比色管，带玻璃球试管（2）试剂：A:显色剂：称取10g磷酸氢二钠，6g磷酸二氢钾，0.5g水合茚三酮，0.3g果糖，用水溶解后定容至100ml（pH6.6－6.8），棕色试剂瓶低温保存B：碘酸钾稀释液：0.2g碘酸钾溶于60ml水中，加入40ml96％乙醇C：标准甘氨酸贮备溶液：准确称取0.1072g甘氨酸，溶解并定容到100ml，4℃保存，使用时稀释100倍。三、实验步骤：（1）样品稀释：稀释样品至含有1－3ug氨基氮/ml（麦汁稀释约100倍，啤酒稀释50倍，样品需除气过滤）（2）滴定：取九支试管，3支吸入2ml甘氨酸标准溶液，3支吸入2ml试样稀释液，3支吸入2ml水对对照；各加10入显色剂1ml，摇匀，在沸水浴中加热16min，然后迅速取出在20℃水浴中冷却至20min，分别加入5ml碘酸钾稀释液，摇匀，在30min内570nm波长下检测。11第五节酒精度测定一、实验原理蒸馏能够将发酵液中的酒精蒸馏出，收集馏出液并测定其密度，根据密度－酒精度对照表可查的酒精含量。（酒精度指在20℃时酒精水溶液与同体积纯水的质量比，求出相对密度，然后查表得出样品中酒精的体积分数）二、实验器材电炉、变压器、铁架台、500ml蒸馏瓶、蛇形冷凝管、100ml容量瓶三、实验步骤1、在精确称量的500ml蒸馏瓶中，用容量瓶称取100ml除气并经过滤的发酵液，用50ml蒸馏水分三次冲洗容量瓶，洗液加入蒸馏瓶中；2、连接好蒸馏装置，冷凝器下端接100ml容量瓶接受馏出液；打开冷凝水，加热至沸腾蒸馏，馏出液接近100ml时停止（时间控制在30－60min）；馏出液在20℃平衡后定容至100ml，混匀；3、使用密度计测定馏出液密度。12第六节双乙酰测定一、实验目的：了解双乙酰含量，监测啤酒质量二、实验原理双乙酰（丁二酮）是赋予啤酒风味的重要物质，但含量过大会引起啤酒的馊味，其风味阈值较低（0.1mg/L），因此，对清爽型啤酒而言，双乙酰含量控制在0.1mg/L，对高档啤酒，双乙酰含量应控制在0.05mg/L以下。葡萄糖经过EMP途径生成丙酮酸和活性乙醛在α－乙酰乳酸合成酶的催化下形成α－乙酰乳酸，其中一部分被排出酵母体外，通过非酶氧化脱羧而形成双乙酰。双乙酰的测定方法有气相色谱法，比色法等。邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法。因此，此法测定所的之值为连二酮的总量，结果偏高。但是啤酒中2，3－戊二酮的量比双乙酰低很多，其风味阈值（1mg/L）比双乙酰较高，对啤酒风味不起多大作用。用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯二胺形成2，3－二甲基喹喔啉，其盐酸盐在335nm波长下有一个最大吸收峰，可进行定量测定。三、实验器材与试剂1、器材：分光光度计，石英比色杯，双乙酰蒸馏装置2、试剂：a)4mol/L盐酸b)10g/L邻苯二胺：精密称取分析纯邻苯二胺100mg/L，13溶于4mol/L盐酸中，并定容到10ml，摇匀，储于棕色试剂瓶中，暗处保存，限当日使用c)消泡剂：有机硅消泡剂或甘油聚醚d)双乙酰标准溶液：准确称取0.5000g双乙酰，溶解于100ml蒸馏水中，棕色试剂瓶储于冰箱中。临用前吸取5.00ml储备液，稀释成1000ml，此溶液的浓度为0.25mg/ml。四、实验步骤1.将双乙酰蒸馏装置安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹打开2.将内装2.5ml重蒸水的容量瓶放于冷凝器下，使出口尖端浸没在水下面，外加冷凝水冷却3.加热蒸汽发生器至沸腾，通气加热夹套，备用4.于100ml容量瓶中加入2－4滴消泡剂，再注入5℃未除气的啤酒100ml5.待夹套蒸馏器下端冒大大气时，打开进气口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸馏器内，再用约10ml蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子，用水封口6.待夹套蒸馏器下端再次冒大大气时，将排气夹夹住，开始蒸馏，待馏出液接近25ml（