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实习4：系统发育分析－PHYLIP,MEGA,MrBayes实验目的：1.学会使用PHYLIP，MEGA和MrBayes构建系统发育树2.学会分析建树结果，体会各种方法差异实验内容：（一）PHYLIP（二）MEGA（三）MrBayes作业：1，用NCBI搜索dehydrin不同物种的序列，找到以下物种。1)、MicroplitisdemolitordehydrinCOR47-like,mRNA372bp2）、Quercuspetraeadhn3genefordehydrin,620bp3）、Alternariabrassicicoladehydrin-likeprotein(DHN2)gene,completecds,alternativelyspliced1,473bplinearDNA4.ColumbaliviadehydrinDHN4-likemRNA648bplinearmRNA5）、Escherichiacolidehydrin(dhnA)gene,completecds2,322bpPHYLIP法：把5个序列用clustalx进行比对，以phylip格式输出，再把phylip粘贴到phy\phylip-3.695\exe文件夹，然后分别用不同方法建树。双击SEQBOOT子程序，输入phylip运行得到outfile，改名为seqb。最大简约法：打开DNAPARS，将刚才生成的seqb文件名输入，修改参数运行后得到的outtree用treeview打开如图1所示（图1最大简约法）（图2NJ法）距离法建树：首先利用DNADIST软件计算两两序列的距离，得到距离矩阵用于下一步分析。将刚才生成的seqb文件输入，更改M参数为分析多个数据，运行后生成文件outfile，改名为dnadist。1）NJ方法：执行NEIGHBOR软件，将上一步生成的dnadist输入，利用NJ方法建树，更改M参数为分析多个数据，生成两个文件outfile和outtree，outtree用treeview打开如图2所示2）UPGMA方法：操作同上，得到如图3（图3UPGMA方法）（图4FM方法）3）FM方法：执行FITCH软件，将dnadist输入，更改M参数为分析多个数据，生成两个文件outfile和outtree，outtree用treeview打开如图4所示最大似然法建树：打开DNAML软件。将刚才生成的seqb文件输入，更改M参数为分析多个数据，生成两个文件outfile和outtree。outtree用treeview打开如图5所示图5最大似然法MEGA法：把5个序列保存为一个txt文件，改为fas格式。打开MEGA,点击Align-Edit/BuildaAlignment，选择createanewalignment。选择DNA,出现新窗口AlignmentExplorer,点主菜单Data-open-retrievesequencesfromfile.打开之前的fas文件，选全部序列进行比对。然后点击Data-ExportAlignment-MEGAFormat，保存比对结果。关闭窗口。点击主菜单File-OpenaFile/session,选择刚保存的meg文件，进行不同方法建树。MicroplitisdemolitorEscherichiacoli80QuercuspetraeaAlternariabrassicicolaColumbaliviaMicroplitisdemolitorEscherichiacoliQuercuspetraeaAlternariabrassicicolaColumbaliviaMicroplitisdemolitorEscherichiacoli99QuercuspetraeaAlternariabrassicicolaColumbalivia（UPGMA法）MicroplitisdemolitorEscherichiacoliQuercuspetraeaAlternariabrassicicolaColumbalivia贝叶斯法:吧5个序列利用clustalx比对，输出nxs.nex文件，粘贴到最大简约法极大似然法NJ法mrbayes-3.1.2文件夹，运行MrBayes，读入nex文件，在控制符后输入exenxs.nex,点击回车，在控制符后输入mcmcngen=10000samplefreq=10，点击回车。在控制符后输入sumpburnin=250点击回车。在控制符后输入sumtburnin=250，点击回车。最后得到的树用treeview打开如图所示贝叶斯法NCBIcommontree总结：每个树都存在差异，因为NCBIcommontree是按照整个物种构建的进化树，由于在物种进化过程中基因会发生趋异或趋同进化，所以其他建树法构建的进化树与NCBIcommontree不同，此外，每个建树方法的算法不一样，所以不同方法构建的发育树存在差异。二．在NCBI中搜索固氮酶蛋白限定为RefSeq，选择一个序列，进行Blastp。下载20种序列，使用MEGA分别通过最大简约法和极大似然法构建树，并于NCBI上的标准物种树比较。首先，可以发现构建的进化树与NCBI上的物种树有很大的差异。如Halothecesp.PCC7418（在标准物种树与ML中标注*号），在物种树中与Cyanothecesp.PCC7822近邻，然而在ML法树形结构中分距很远。此外，我们可以看出，虽然在物种树里面的各节点分别代表31个不同的物种，但属名相同的物种往往近邻或成簇。据上所述，物种树与蛋白序列树显现出了较明显的不一致性，推测这是由分子进化事件（即基因重复或丢失）产生的。