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生物分离工程亲和纯化技术总体学习目的和要求理解生物亲和作用的本质，影响因素和作用体系。亲和纯化的原理与操作。了解几种常用亲和纯化方法。目录生物亲和作用亲和色谱原理亲和色谱介质亲和吸附平衡亲和色谱的应用亲和膜色谱其它亲和分离技术生物亲和作用-学习要点识记：生物亲和作用的概念理解：生物亲和作用的本质，影响亲和作用的因素应用：了解常用的亲和作用体系亲和作用的由来Affinity一词源于拉丁语的affinitus，意为结婚或亲缘关系生物亲和作用-定义生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用生物亲和作用-本质亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理尚不清楚蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，形成构象上的钥匙-锁关系亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多种力的相互作用亲和作用中的静电作用中性pH值下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸等酸性氨基酸残基带负电荷，精氨酸、赖氨酸和组氨酸等碱性氨基酸带正电荷N末端氨基酸α-氨基带正电荷，C末端氨基酸的羧基带负电荷近距离上产生强烈的静电引力亲和作用中的氢键作用亲和作用的分子对的一个分子中含有氧原子或氮原子，结合部位之间形成O-H-O或O-H-N的氢键作用氧和氧或氮和氧原子需与氢原子基本排列在一条直线上，且原子之间的距离达到一定程度氢键的产生与否受结合部位之间的位置关系的严格制约亲和作用中的疏水性相互作用如果亲和作用的分子对的一个分子中含有芳香环或羟基链等疏水基，另一方的结合部位上也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性相互作用苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸生物亲和作用-亲和作用中的相互作用力静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键亲和作用静电作用氢键疏水性相互作用配位键弱共价键除具备“钥匙”和“锁孔”的关系外，生物亲和作用还需存在特殊的相互作用力，这也是亲和作用特异性高的主要原因生物亲和作用-影响亲和作用的因素离子强度pH抑制氢键形成的物质温度离液离子螯合剂离子强度对亲和作用的影响亲和作用主要源于静电引力，提高离子强度会减弱或完全破坏亲和作用；提高离子强度也会降低或消除氢键作用；当亲和结合作用主要源于疏水性相互作用，增大离子强度则可提高亲和结合作用；pH值对亲和作用的影响作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基团，不同解离基团具有不同的解离常数；如果静电引力对亲和结合作用贡献较大，pH值会严重影响亲和作用，即适当的pH值下亲和结合作用较高，而在其他pH值下亲和结合作用减弱直至消失；其它因素对亲和作用的影响抑制氢键形成的物质如果亲和结合作用中存在氢键，则加入脲或盐酸胍可减弱亲和作用。温度温度升高使分子和原子间热运动加剧，减弱静电作用、氢键和配位键；增强疏水性相互作用离液离子螯合剂如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配位键，加入乙二胺四乙酸等螯合剂除去金属离子会使亲和作用消失常见的亲和作用体系特异性亲和体系高特异性抗原-单克隆抗体荷尔蒙－受体蛋白核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白酶－底物、产物、抑制剂群特异性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－辅酶凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质-肝素酶、蛋白质-活性色素（染料）酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）亲和纯化定义将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，可特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子从混合物中得到选择性分离纯化的方法称为亲和纯化。在亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中被固定的分子称为亲和结合对象的配基。亲和分配平衡在亲和作用体系中，如果用L表示配基，E表示蛋白质，则配基和蛋白质之间的结合反应可表示为结合常数eqKLELELELEdKLELEeqK结合常数越大（或解离常数越小），表示亲和结合作用越强。一般亲和体系的结合常数为104～108L/mol，最高可达到1015L/mol，此时的亲和结合基本上不可逆的。亲和色谱原理-学习要点理解：亲和色谱的原理与操作亲和色谱定义亲和色谱是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。亲和色谱所用的固定相为键合亲和配基的亲和吸附介质（亲和吸附剂）亲和色谱原理亲和色谱操作与一般的固定床吸附操作方式相似，多采用断通式前端分析法，分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱合层析柱再生四步。亲和色谱原理料液进料（feedstockloading）含有目标产物的料液连续通入色谱柱，直至目标产物在色谱柱出口穿透杂质清洗(contaminantwashing)利用与溶解原料的溶液组成相同的缓冲液为清洗液，清洗色谱柱除去不被吸附的杂质；产物洗脱(targetproductelution)利用可使目标产物与配基解离的溶液洗脱目标产物柱再生（columnregeneration)利用清洗液清洗再生色谱柱亲和色谱介质－学习要点理解：间隔臂的作用，常用亲和配基种类应用：了解亲和配基的固定方法，应用实例以及亲和吸附介质的要求亲和配基－酶、抗体和蛋白酶的抑制剂蛋白酶均存在抑制其活性的物质，称为酶的抑制剂。它的分布很广，有天然的生物大分子，如胰蛋白酶抑制剂（结合常数为109L/mol），也有小分子化合物如氨基苄脒（结合常数为4×104L/mol）。抗体抗体和抗原之间具有高度特异性结合能力，结合常数在107~1012L/mol蛋白A（或称A蛋白）A蛋白为分子量42kDa的蛋白质，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中。它与动物免疫球蛋白G（IgG）具有很强的结合作用。亲和配基－凝集素和色素凝集素凝集素是与糖特异性结合的蛋白质的总称。在这种蛋白质上具有糖的结合位点。可作为多糖、糖蛋白等含糖生物分子的配基。辅酶和磷酸酰苷各类脱氢酶和激酶需要在辅酶存在下表现出其生物催化活性。辅酶和脱氢酶之间有亲和作用。三嗪类色素这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用，能与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等发生结合作用亲和配基－过渡金属等过渡金属离子Cu2+等过渡金属离子可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基发生亲和结合作用。Cu2+等过渡金属离子与N、O和S等供电原子产生配位键。组氨酸肝素肝素是存在于动物肝脏等器官中的酸性多糖类物质，分子量为5到30kDa，它与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和作用。亲和色谱-亲和配基亲和色谱-亲和色谱介质应满足条件具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附；物理和化学稳定性高，有较高的机械强度含有可活化的反应基团粒径均一的球形粒子亲和色谱-亲和配基固定化亲和配基的固定化方法介质的活化介质的活化方法－溴化氰法溴化氰活化法用于亲和色谱介质连接含有氨基的配基最初的溴化氰活化法，需要加入NaOH至pH为11，成功地将配基连接到软性介质上。但是，溴化氰是剧毒试剂，并且具有挥发性。溴化氰活化介质后形成的氰氧基容易水解，而影响偶联效率，活化后的介质带有较强的电荷，导致非特异性吸附增加等。介质的活化方法－环氧基法环氧氯丙烷活化具有方便、快速、活化率高，毒性低的特点，是目前广泛采用的制备方法。活化方法：将介质用水冲洗后，加入环氧氯丙烷和适当浓度的NaOH，然后振荡反应2.5h左右。为了得到更高的活化效率，其中环氧氯丙烷和NaOH的用量，NaOH的浓度，反应时间都可以根据具体实验做出调整。由于环氧氯丙烷为油相，而NaOH溶液为水相，为了促进两者反应的进行，通常在混合物中加入助溶剂二甲基亚砜（DMSO）。介质的活化方法－羰基二亚胺法亲和色谱-间隔臂的作用当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接一个“间隔臂”间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱亲和色谱-影响亲和吸附的因素杂质的影响料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降低纯化效果杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关料液流速流速的增大，分离速度加快，但柱效降低亲和色谱-目标产物的特异性洗脱特异性洗脱利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。特异性洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性。另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系或非特异性吸附较为严重的物系，特异性洗脱有利于提高目标产物的纯度。亲和色谱-目标产物的非特异性洗脱非特异性洗脱是提高洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。当亲和结合力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产物时，可利用脲或盐酸胍等变性溶液使目标产物发生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不可逆变性，需慎重使用。亲和膜-学习要点理解：亲和膜原理和特点应用：了解亲和膜的实际应用亲和膜-定义亲和膜是利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。亲和膜-亲和膜的提出固定床亲和层析的缺陷以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速受限放大困难（放大采用径向放大）亲和膜思路提出“降低柱高、增大柱径以降低压降、提高流速”亲和膜-亲和膜的原理亲和配基固定在膜孔表面，流体在对流状态下透过膜孔的过程中目标蛋白与配基接触而被吸附亲和错流过滤-学习要点理解：亲和错流过滤原理和特点应用：了解亲和错流过滤的实际应用亲和错流过滤-定义亲和错流过滤是生物亲和相互作用与膜分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术亲和错流过滤-原理传统的膜过滤对蛋白质的分离是基于分子量大小的差异；分子量相差10倍以上的物质可得到分离，选择性差；将亲和配基固定于某些水溶性聚合物或不溶性微粒后，目标蛋白质将选择性地吸附于这些修饰亲和配基的材料上，从而在目标蛋白质与杂蛋白之间形成较大的尺寸差，提高膜分离选择性目标产物被截留并经洗脱获得纯品亲和错流过滤-特点优点吸收膜分离的优点，易于放大和连续操作吸收亲和吸附高选择性的特点亲和载体无内扩散阻力，目标分子的亲和结合速度快缺点一级吸附平衡、一个理论板、效果差其他亲和过程-学习要点理解：上述亲和纯化方法的原理和操作应用：了解上述方法的适用范围其他亲和过程-亲和双水相萃取亲和双水相萃取是利用偶联亲和配基的聚乙二醇作为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取在亲和配基的亲和作用下，促进目标蛋白在PEG相中分配，提高分配系数和选择性其他亲和过程-亲和反胶团萃取亲和反胶团是指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子亲和作用，促进目标产物在反胶团相分配。其他亲和过程-亲和沉淀定义亲和沉淀是生物亲和作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离技术，包括一次作用亲和沉淀和二次作用亲和沉淀。其他亲和过程-一次作用亲和沉淀原理水溶性化合物偶联多个配基，蛋白质表面含有两个以上亲和结合位点化合物与蛋白质因亲和作用产生亲和交联交联形成的交联网络因分子量较大而沉淀其他亲和过程-二次作用亲和沉淀原理利用在物理场改变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀