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昆虫几丁质酶的分类、功能分析及酶学性质的研究进展摘要：昆虫几丁质酶及其类似蛋白在昆虫生长和发育阶段起到重要调节作用。最近几年，运用新的生物技术对昆虫几丁质酶的结构，时空表达，和组织特异性表达以及生物学功能进行了深入研究，取得了许多新的成果。本文就昆虫几丁质酶基因的结构特征，几丁质酶生理功能、重组表达特点、酶活测定方法及影响酶活性因素等方面进行讨论与综述。关键词：昆虫几丁质酶，结构分类，功能分析，重组表达，酶学性质Abstract:Intheinsectgrowthanddevelopmentstages,insectchitinaseandchitinase-likeproteinsplayanimportantregulatoryrole.Inrecentyears,newtechnologieswereappliedforthestructureofinsectchitinase,timeandspaceexpression,tissuespecificexpressionandbiologicalfunctionofinsectchitinase,andgotmanynewresearchachievements.Inthispaper,thestructureofinsectchitinasesclassification,physiologicalfunction,recombinantexpression,methodsofdetectionofenzymeactivityandinfluencingfactorsofenzymeactivityandotheraspectsarediscussedandreviewed.Keywords:Insectchitinase;Classificationstructure;Physiologicalfunction;Enzymeproperty几丁质是由β-1，4-糖苷键连接而成的(GluNAc)2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄吡喃糖苷的线性多聚物，是继纤维素之后的第二大丰富的生物聚合物[1]，它广泛分布于真菌、线虫和节肢动物中。在节肢动物中，几丁质是表皮和外骨骼生长发育的关键，许多昆虫和其他节肢动物的内部结构中也发现了几丁质，包括表皮内部的气管、围食膜和中肠上皮[2]。几丁质酶(EC.3.2.1.14)是一类能把几丁质降解为低分子量、可溶或不可溶的N-乙酰-D-氨基葡萄糖或寡聚N-乙酰胺基葡萄糖的水解酶，广泛分布于细菌、真菌、植物、线虫、节肢动物以及脊椎动物(如人类、小鼠、鸡等)中[3]。昆虫几丁质酶属于18家族几丁质糖基水解酶，主要作用于昆虫蜕皮过程中，参与其新旧表皮的更替和围食膜的降解[4,5]。昆虫几丁质酶在昆虫生长发育阶段中不正常的组织特异性和时空特异性表达，都会影响昆虫的正常生长。新的研究表明，昆虫体内存在多个编码几丁质酶的基因[7]，因此昆虫几丁质酶基因分类研究也深入开展。特别是最近几年运用生物信息学、系统发育进化分析、RT-PCR、Real-timequantitativePCR、RNAi等技术手段对昆虫几丁质酶的结构、时空表达和组织特异性表达以及生物学功能进行了深入的研究，取得了许多新的研究成果。鉴于昆虫几丁质酶的结构分类、重组表达以及酶学性质在酶学研究中的基础作用，本文就以上内容做出综述。1昆虫几丁质酶1.1昆虫几丁质酶的多样性昆虫几丁质酶的多样性主要体现在两个方面：一方面是由昆虫几丁质酶催化作用性质所决定；另一方面是由昆虫几丁质酶基因结构与功能所决定。目前对于第一方面的研究已经相当深入，目前发现的几丁质酶基本包含3种形式，主要为内切酶、外切酶和N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷酶等。几丁质内切酶的裂解产物为GlcNAc寡聚糖，在几丁质内部发生作用；外切酶是以二乙酰基壳二糖(diacetylchitobiose)为单位顺次裂解，发生于多糖链的非还原端；可以使双糖水解为单糖的是N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetyl-D-glucosaminidase,NAGase)，并且可以以多糖链的非还原端为开端进行外切，进而具有水解单糖的酶活力。内切几丁质酶和β-N-乙酰葡萄糖胺酶是昆虫主要的催化水解几丁质的酶。1.2昆虫几丁质酶的类型和功能分析近年来，昆虫几丁质酶及类似蛋白结构与功能的研究愈加显著。随着越来越多的昆虫基因组序列的测定完成，更多的昆虫几丁质酶基因得到认可，如双翅目：冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)、长须罗蛉(Lutzomyialongipalpis)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)鳞翅目：云杉卷叶蛾(Sprucebudworm)、番茄夜蛾(Lacanobiaoleracea)、烟草天蛾，鞘翅目：赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)、黄粉虫(Tenebriomolitor)，膜翅目：切叶蚁，半翅目：豌豆长管蚜。近年来，人们对昆虫几丁质酶及类似蛋白的分类进行了更加深入的研究，Zhu等(2008b)和Arakane等(2010)先后利用生物信息学和系统进化树等分析方法将昆虫几丁质酶及其类似蛋白的结构分为5类和8类，随后在2011年Zhang等(2011b)对冈比亚暗蚊(Anophelesgambiae)进行了生物信息学与转录特征分析，进一步证明了8种类型的昆虫几丁质酶及其类似蛋白在昆虫不同生长发育阶段和不同组织中的作用具有很大的差异性，并且发现这个差异性在果蝇、赤拟谷盗和其他的一些昆虫物种中也是普遍存在的。根据新的分类[12]，Ⅰ型昆虫几丁质酶8种类型的昆虫几丁质酶基因中是最具特征的，它包含一个信号肽区(signalpeptide)、一个酶活性位点区(catalyticdomain)、一个糖基化和磷酸化位点的连接区(linker)和一个富含半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸的几丁质结合区(chitin-bindingdomain,CBD)，RNA干扰实验表明，它的主要作用是水解消化昆虫化蛹后旧的表皮。Ⅱ型昆虫几丁质酶氨基酸序列较大，它包含4~5个催化区和4~7个CBD区，Zhu等(2008c)通过RNA干扰使TcCHT10基因沉默后，发现TcCHT10在幼虫-幼虫阶段、幼虫-蛹阶段、蛹-成虫蜕皮阶段和卵孵化阶段具有重要的作用。Ⅲ型昆虫几丁质酶的N端包含一个跨膜结构，两个催化区和一个CBD区，它可能与昆虫化蛹后腹部收缩和翼/翅鞘立即伸展有关，但对幼虫-幼虫的蜕皮、化蛹时期和成虫羽化是可有可无的。Ⅳ型昆虫几丁质酶大多数缺少CBD区，它包含单一的信号肽和催化区，研究结果表明，Ⅳ型昆虫几丁质酶主要在幼虫和成虫阶段表达，而在预蛹期、蛹期和胚胎阶段均没有进行表达，更重要的是Ⅳ型昆虫几丁质酶主要在幼虫肠道组织中表达，由此推测对于围食膜几丁质含量的调控Ⅳ型昆虫几丁质酶的作用是不可忽视的。Ⅴ型昆虫几丁质酶没有CBD区只包含有一个信号肽和高度保守的催化区，Ⅴ型几丁质酶类似蛋白的成虫盘生长因子(IDGFs)主要在卵黄细胞和脂肪体细胞中表达，可能与调控细胞增殖和昆虫细胞的重构有关；在研究TcIDGF4时发现，其基本没有几丁质酶活性，但是在成虫羽化过程中起到不可或缺的作用。Ⅵ型昆虫几丁质酶和Ⅰ型具有类似结构，但Ⅵ型C-端连有一个含20%~30%丝氨酸/苏氨酸残基的卷曲蛋白，预测该蛋白可能是高度糖基化并且可能具有抗蛋白酶功能。Ⅶ型昆虫几丁质酶(CHT2s)与Ⅳ型结构域相似，系统发育分析表明Ⅶ型几丁质酶在Ⅱ型几丁质酶的离群值近。Ⅷ型昆虫几丁质酶(CHT11s)有一个催化结构域但没有CBD，N-端有一个跨膜区，其可能是膜相关蛋白。1.3昆虫几丁质酶生化特性与生理功能综合多种昆虫几丁质酶的物理、化学及动力学特性分析[8,9]得到：昆虫几丁质酶的分子量约为40~85kD，酶的活性区间为pH4.0~8.0，等电点pI为5~7，最适温度比甲壳类动物相对低10~15℃。昆虫几丁质酶是一种糖蛋白，存在于昆虫生长发育各个阶段和各个组织中，包括蜕皮液、毒腺和中肠，其作用是水解昆虫体壁和中肠中的几丁质。昆虫生长发育期间蜕皮液中的几丁质酶，可以准确调节昆虫周期性脱去旧表皮并且合成新表皮的过程。在昆虫蜕皮过程中，几丁质和几丁质酶之间是一种动态作用过程，包括经过CBD区的吸附过程、水解过程、解吸附过程及活性催化区对于底物表面作用的配置过程。毒腺中的几丁质酶对于毒腺物质在猎食对象中的组织渗透具有促进作用。中肠中的几丁质酶可以降解中肠壁和围食膜中的几丁质，还具有消化功能。2昆虫几丁质酶的表达2.1昆虫几丁质酶的体内表达自Kramer等(1993)年首次从烟草天蛾(Manducasexta)中克隆得到编码昆虫几丁质酶的cDNA序列以来，越来越多的昆虫几丁质酶基因被克隆，如：黄粉虫，赤拟谷盗，亚洲玉米螟等。昆虫几丁质酶在不同生长发育阶段的表达是不同的。在研究烟草天蛾表皮和肠道几丁质酶表达时，Kramer等(1993)使用SlotBlot方法发现，几丁质酶只在幼虫蜕皮、化蛹或者蛹羽化成成虫之前的短暂的时间内开始表达，并且从幼虫到蛹的阶段几丁质酶的表达量比较高，而幼虫取食期间几丁质酶基因是不表达的。最近Zhang等(2011c)研究表明，冈比亚按蚊的几丁质酶基因AgCht8主要在化蛹和成虫阶段表达，而在幼虫阶段是不表达的。昆虫生长发育过程中，几丁质酶的表达具有组织特异性。对烟草天蛾几丁质酶组织特异性表达研究表明，几丁质酶mRNA的浓度由低到高依次是脂肪体＜肌肉＜体壁＜中肠，其中中肠中的浓度最高，脂肪体检测不到mRNA浓度。RT-PCR分析得到冈比亚按蚊中AgCht2和AgCht12主要在前肠中表达，而AgCht13主要在中肠中表达(Zhangetal.,2011c)。由此可知，昆虫几丁质酶在昆虫体内具有时空特异性表达的特点。昆虫在不同的生长发育阶段，不同类型的昆虫几丁质酶在同一组织中的表达是不同的，并且在同一生长时期的不同组织中的昆虫几丁质酶表达也有较大差异。然而，昆虫在幼虫的蜕皮阶段、化蛹阶段的几丁质酶表达量都会较高，有些昆虫在蛹期的特定阶段和羽化阶段的几丁质酶表达量也会较高。2.2昆虫几丁质酶的体外表达研究目前对于昆虫几丁质酶的体外表达有两种方法，一种是大肠杆菌表达系统，可以选用pET、pRSET、pMAL、pGEX等原核表达载体，但是大肠杆菌表达系统表达的酶活性相对较低，有些甚至出现无酶活性的包涵体；另一种是昆虫细胞系表达系统，研究发现昆虫细胞系表达的昆虫几丁质酶是经过糖基化修饰的，与昆虫体内的几丁质酶的糖基化修饰相似，所以其表达的酶活性显著高于大肠杆菌表达系统表达的酶活性[14]。笔者在使用大肠杆菌表达系统对舞毒蛾和金纹细蛾几丁质酶进行表达时，大肠杆菌表达系统表达的两种外源蛋白的存在形式是无活性包涵体，虽然之后我们使用pMAL载体表达的外源蛋白可以形成可溶性蛋白，但对几丁质酶活性进行检测时发现活性很低，之后我们采用SF9昆虫细胞系表达系统，蛋白酶活性明显增强[7]。Kramer等(1993)将烟草天蛾几丁质酶基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组进行重组，将重组病毒转染SF9细胞进行表达，并且进行Westernblot分析，研究表明，重组病毒在细胞504中表达分泌的蛋白是一种糖蛋白；随后比较了其在SF9、SF21和Hi-53种昆虫细胞中的表达水平及活性，3种细胞的表达水平依次为Hi-5＞SF21＞SF9；同时，将蜕皮液中分离得到的野生型几丁质酶与Hi-5细胞表达的重组几丁质酶进行气相色谱分析发现，在Hi-5细胞内表达的几丁质酶蛋白的碳水化合物组成与野生型烟草天蛾蜕皮液中得到的几丁质酶蛋白的相似，都包含葡萄糖、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖，约占酶质量的25%，表明昆虫几丁质酶体外真核表达效率要高于自身体内表达，并且有利于其酶学性质的研究。3昆虫几丁质酶的酶活测定方法及其影响因素3.1昆虫几丁质酶的酶活测定方法由于几丁质在自然状态下具有不可溶性，并且几丁质的物理状态对几丁质酶的活性影响较大，因此在几丁质酶活