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1蛋白质、核酸大分子分离、纯化1、生物材料的选择：⑴含量丰富⑵易于处理和提取2、生物材料的破碎和预处理组织匀浆法，研磨3、粗分离离心、盐析、有机溶剂沉淀、胶体吸附等4、纯化各种层析技术【离子交换层析、亲和层析技术（比较贵，一般要求纯化到95%以上时才使用）】5、产物的浓缩干燥和保存6、鉴定⑴物理化学性质鉴定⑵生物活性鉴定蛋白质的理化性质1、蛋白质的分子量2、蛋白质的两性解离和等电点3、蛋白质的交替性质4、蛋白质的沉淀5、蛋白质的呈色反应6、蛋白质的紫外吸收7、蛋白质的变性与复性蛋白质分子分离纯化的一般原理1、分子大小不同层析、透析、超滤、电泳2、溶解度不同盐析、等点沉淀、有机溶剂沉淀3、所带电荷不同电泳、离子交换层析4、对配基的特异性酶和特异性蛋白（亲和层析）例：盐析法的一般原理原理：通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各种成分分步“盐析”出来，达到分离蛋白质的目的，是粗分离蛋白质的重要方法之一。优点：操作简单，经济实用【目前(NH4)2SO4最为广泛，其优点：溶解度大；不受温度影响；对蛋白质的活性没有影响；分离效果好，纯度可提高5倍；经济实用】DNA的性质1、DNA呈酸性，易溶于微碱性溶液中，但不溶于有机溶剂（用冷乙醇沉淀）2、DNA分子很长，溶液呈粘稠状3、DNA分子本身具有刚性，易受剪切力的作用4、DNA易受DNA酶作用而降解加入SDS（蛋白质变性剂，抑制酶的活性），EDTA—柠檬酸溶液5、DNA的变性与复性6、紫外吸收（260nm）2DNA的制备原理1、DNA蛋白和RNA蛋白在不同的盐溶液中的溶解度不同：DNA蛋白溶于高盐，RNA蛋白溶于低盐，使用高速冷冻离心机2、蛋白质的变性：氯仿，抽提3、DNA不溶于有机溶剂：用95%的冷乙醇提炼核蛋白低盐溶液（反复离心）DNA核蛋白RNA核蛋白反复抽提DNA蛋白质乙醇沉淀纯化的DNA主要杂质：蛋白质和RNA蛋白质、核酸的含量测定一、蛋白质的含量测定1、凯式定氮法蛋白质中氮元素含量大约是16%，蛋白质含量=含氮量*6.252、双缩脲法（分光光度法）双缩脲是由两分子尿素缩合成的化合物，分子中的两个(CO-NH)在碱性溶液中能与Cu2+反应生成紫红色络合物。该反应稳定，操作简便，但灵敏度较低，适于测定蛋白质浓度较高的样品(1~10mg/ml)。3、Folin—酚Folin—酚试剂法(Lorry法)是测定可溶性蛋白的标准方法。该法是在双缩脲反应基础上，再加入酚试剂(含磷钼酸及磷钨酸)进一步反应。蛋白质酪氨酸酚羟基将酚试剂还原成蓝色化合物(钼蓝和钨蓝的混合物)，因而可使反应灵敏度提高一个数量级。4、考马斯亮蓝法考马斯蓝分子通过范德华力、疏水作用和静电力可与蛋白质进行物理结合。结合后的考马斯蓝颜色繁盛变化，通过比色可定量蛋白质。此法操作简单，反应灵敏，可测微克量级蛋白质样品。有不同类型的考马斯蓝：考马斯蓝R-250和考马斯蓝G-250。由于R-250比G-250灵敏，常用于电泳凝胶的蛋白质染色。在蛋白质浓度高时，R-250显色不符合Beer定律，因此常用G-250定量溶液中的蛋白质。利用考马斯蓝G-250结合法定量蛋白质又叫Bradfold法。5、紫外分光光谱法是通过测定在280nm处光吸收值完成的。蛋白质中含有Tyr，Trp，Phe。该法测定快速，而且测定后样品不损失，常用于蛋白质纯化过程中洗脱峰的检测。二、核酸含量的测定1、定磷法2、定糖法3、紫外分光光度（共轭双键）光谱分析技术（分光光度计）722型光吸收定律（Lanbert-Beer）3（光密度）OD=KCL光被吸收的量度与溶液的浓度与液层的厚度成正比，K为消光系数；L比色杯厚度1cm；C摩尔浓度。层析技术一、原理：由于被分离的混合物各组分的物理化学性质不同，当通过一个互不相容的两相（固定相和流动相）组成的体系，各组分在两相间的分配不同，且随流动相向前移动，各组分不断地两相中进行再分配。分部收集出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。二、分类1、吸附层析效果不是很好，利用吸附力不同。2、分配层析操作麻烦，利用溶解度不同3、离子交换层析利用所带电荷不同，静电引力不同4、凝胶层析根据蛋白质分子大小不同；固相凝胶具有分子筛作用。5、亲和层析比较贵，但是分离效果好，一般用于核酸分离凝胶层析原理利用固定相具有网眼的海绵状基质构成一定大小的网孔对流动相中被分离物质相对分子质量不同分离的层析技术。具有分子筛效应的凝胶有4种：1、葡聚糖2、琼脂糖核酸配合电泳3、聚丙烯酰胺蛋白质配合电泳4、玻璃球凝胶也用于蛋白质盐析后除盐凝胶层析的操作步骤：1、胶的选择：75g以下叫硬胶。2、制胶：使用前必须水化（温水浸泡；煮沸）3、灌柱：柱要直；要均匀，不能进空气；注意柱长与样品比例；柱面要平整（做到柱面平整，需要连续灌柱）4、平衡：用洗脱液平衡15min。5、加样：血红蛋白3滴+溴酚蓝1滴6、洗脱：流速控制在10~15滴/min7、收集：分段收集8、鉴定：物理化学性质鉴定；生物活性鉴定9、胶的回收与再生注意事项：1、胶的预处理要彻底；洗脱液漂洗与浸泡方式2、垂直装柱并不许出现裂纹或断层3、连续装柱，保证柱面平整离子交换层析原理离子交换层析就是利用键合在固定相表面的具有交换离子能力的离子基团，根据流动相待分离组分的离子可逆结合能力的差异，进行物质分离的一类柱层析技术。4离子交换剂：不溶性高分子母体：1、纤维素（使用比较多）2、树脂3、葡聚糖4、琼脂糖可离解性基团：酸性基团碱性基团（胺碱）实验步骤：1、装柱：DEAE—纤维素或树脂（可能会考纤维素层析蛋白质）2、平衡：3、加样：IgG或细胞色素C4、洗脱：流速10-15滴/min5、收集：6、鉴定：7、胶的回收与再生：电泳技术原理：在溶液中，蛋白质分子或核酸分子由于解离儿带电荷；在电场中，蛋白质或核酸带电粒子会向与自身电荷相反的电极泳动。迁移速率与其分子形状以及电荷性质有关。影响电泳的因素：1、电场强度2、溶液的PH3、溶液的离子强度4、电渗现象5、温度电泳分类1、装置不同：圆盘电泳；平板电泳2、支持物不同：聚丙烯酰胺凝胶（蛋白质）；琼脂凝胶（核酸）聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在自由基引发剂（如硫酸铵和催化剂TEMED（四甲基乙二胺））作用下，能聚合交联成网状凝胶，聚合反应需要无氧条件。聚丙烯酰胺凝胶的特点：1、凝胶浓度可逆：通过调节丙烯酰胺和Bis的浓度可以获得网孔大小不同的凝胶。丙烯酰胺浓度越高，凝胶网孔越小2、凝胶铸形可选：可以为垂直板，也可以是其他3、凝胶中可加入其他物质：通常加入溴酚蓝试剂指示电泳前沿4、电渗小：聚丙烯酰胺凝胶电泳操作简单，分辨率高。聚丙烯酰胺凝胶电泳多采用垂直不连续电泳：两层凝胶在浓度、缓冲液PH和缓冲液组分上不同，上层为大孔径的浓缩胶，丙烯酰胺浓度一般小于5%；下层为小孔径的分离胶，丙烯酰胺浓度一般大于7%。蛋白质样品点样孔位于浓缩胶上端。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质分离效果好，主要基于三种物理效应：浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。实验步骤：1、制胶（分离胶和浓缩胶）2、制版53、加样（血清）4、电泳5、染色（考马斯亮蓝）6、脱色琼脂糖凝胶电泳鉴定（质粒与PCR产物）琼脂糖凝胶电泳方法简单，易操作，快捷，常用于核酸鉴定上。实验步骤1、制胶板：流体状态是，倒入电泳槽2、加样：质粒样品，PCR产物3、电泳4、观察：使用溴化乙锭（EB）染色后，在紫外灯下核酸条带有荧光显示注意事项：1、微量？2、防止EB污染3、防止紫外伤害*EB一种荧光剂，染色时它插入DNA分子的两个碱基之间，形成在紫外灯下支出橙黄色荧光。聚合酶链式反应（PCR扩增技术）三大特点：1、特异性：PCR反应只有一个产物2、高效性：经多次循环，可使特异DNA扩增达到数百万倍。3、忠实性：在聚合过程中，错配几率很少。主要步骤：1、变性：温度为94℃2、退火：退火温度小于引物Tm值5℃3、延伸：延伸温度为72-75℃这三个基本步骤循环进行，可使特异DNA扩增达到数百万倍，循环次数设定：30~35次。PCR反应条件：1、模板DNA2、PCR反应缓冲液3、引物4、底物浓度（dNTP）5、DNA聚合酶：目前广泛使用的是TagDNA聚合酶，是从水生嗜热菌中提取，2496bp，832AA组成。它适宜温度较广，在70~75℃条件下活性最高，在95℃下40min仍保持一半酶活性。该酶具热稳定性，离子依赖性（Mg2+）6、循环次数：30~35次DNA重组（基因工程）质粒在DNA重组技术中的作用：质粒是DNA重组技术的载体。质粒提取的主要步骤：1、细菌培养2、细胞处理：离心，收集具体，加入SDS使细胞充分裂解）3、除去染色体DNA，蛋白质，细胞膜碎片4、除去蛋白（苯酚+氯仿，反复抽提）5、乙醇沉淀