生物化学技术原理及应用.

南京农业大学生命科学学院生物化学技术原理及应用第七章光谱与质谱2019/12/212南京农业大学生命科学学院紫外-可见光谱红外光谱质谱法核磁共振1234分光光度法5荧光分析法62019/12/212南京农业大学生命科学学院第七章光谱与质谱光谱是复色光经过色散系统（如棱镜、光栅）分光后，被色散开单色光按波长（或频率）大小而依次排列的图案。光波是由原子内部运动的电子产生的。各种物质的原子内部电子的运动情况不同，所以2019/12/213南京农业大学生命科学学院它们发射的光波也不同。研究不同物质的发光和吸收光的情况，有重要的理论和实际意义，已成为一门专门的学科——光谱学。2019/12/21南京农业大学生命科学学院4第七章光谱与质谱由于每种原子都有自己的特征谱线，因此可以根据光谱来鉴别物质和确定它的化学组成，这种方法叫做光谱分析。做光谱分析时，可以利用发射光谱，也可以利用吸收光谱．这种方法的优点是非常灵敏而且迅速。某种元素在物质中的含量达10-10克，就可以从光谱中发现它的特征谱线，因而能够把它检查出来。光谱的分类：按波长区域不同，光谱可分为红外光谱、可见光谱和紫外光谱；按产生的本质不同，可分为原子光谱、分子光谱；按产生的方式不同，可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱；按光谱表观形态不同，可分为线光谱、带光谱和连续光谱。2019/12/215南京农业大学生命科学学院第七章光谱与质谱由于每种原子都有自己的特征谱线，因此可以根据光谱来鉴别物质和确定它的化学组成，这种方法叫做光谱分析。做光谱分析时，可以利用发射光谱，也可以利用吸收光谱．这种方法的优点是非常灵敏而且迅速。某种元素在物质中的含量达10-10克，就可以从光谱中发现它的特征谱线，因而能够把它检查出来。光谱的分类：按波长区域不同，光谱可分为红外光谱、可见光谱和紫外光谱；按产生的本质不同，可分为原子光谱、分子光谱；按产生的方式不同，可分为发射光谱、吸收光谱和散射光谱；按光谱表观形态不同，可分为线光谱、带光谱和连续光谱。2019/12/216南京农业大学生命科学学院第七章光谱与质谱分光光谱技术可用于：通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成；通过测量适当波长的信号强度确定某种单独存在或其他物质混合存在的一种物质的含量；通过测量某一种底物消失或产物出现的量同时间的关系，示踪反应过程。鉴定分子式、结构式的方法（四大名谱）：质谱。离子峰、碎片峰，物质大小测定。紫外光谱。反映分子中共轭体系状况。红外光谱。官能团鉴定、分子中环、双键数目。核磁共振。验证上述方法的正确性，提供分子二、三级结构信息。2019/12/217南京农业大学生命科学学院第一节紫外-可见光谱有机分子吸收紫外光后，发生电子能级的跃迁，所测得的吸收光谱；一般紫外光谱仪所用的波长范围为200nm-800nm，即包括可见光区，因而也叫紫外-可见光谱。在有机化合物的结构测定中，紫外-可见光谱与红外光谱不同，它一般不能用来鉴别具体的官能团，而能用来推测分子中是否存在发色团和共轭体系，只要分子含有相同的发色团和共轭体系，就有十分相似的紫外光谱。有机物的紫外吸收光谱受共轭效应，互变异构效应及溶剂效应等因素影响。2019/12/218南京农业大学生命科学学院第一节紫外-可见光谱紫外光谱的应用：单独使用紫外光谱进行有机化合物结构分析比较困难，紫外光谱只有与其它物理、化学资料及其它光谱方法结合，才能发挥较大作用。紫外光谱在确定发色团种类，判断某些方面的异构体及确定不饱和化合物的结构骨架等方面起重要作用。在结构分析中应用：顺反异构体的判别；有机化合物可能结构的推断；有机物分子量的确定。注意：近紫外区200~300nm空气无干扰测定时样品放在石英杯中紫外区小于200nm空气有吸收峰，须在真空中测定谱带特征位置、定性由辐射波长而定；强度、定量由辐射能量决定。2019/12/219南京农业大学生命科学学院第一节紫外-可见光谱紫外光谱的应用：从吸受光谱中初步推断官能团：一个化合物在220-800nm范围内无吸收（ε1），它可能是脂肪族饱和碳氢化合物、醇、醚、羧酸、胺等，不含直链或环状共轭体，没有醛、酮等基团。在210-250nm有吸收带，可能含量2个共轭单位250-300nm有弱吸收带，表示有羰基存在。异构体的推定：许多异构体可以利用双键位置不同，通过紫外吸收光谱推断异构体结构。化合物骨架的推定：未知化合物与已知化合物的紫外吸收光谱一致时，可以认定两者具有同样的发色团。通过这个原理可以推定未知化合物的骨架。2019/12/2110南京农业大学生命科学学院第二节红外光谱研究红外光谱的方法主要是红外吸收光谱法，即用连续波长的红外光为光源照射样品，分子发生键振动能级的跃迁，所测得的吸收光谱。红外光谱图中的吸收峰是由键的振动引起的，同一类型的化学键振动频率非常相似，总是出现在某一固定范围内，因此有机化合物中的各类官能团和一些基团具有特征的吸收峰。根据官能团区吸收峰位置可以推测未知化合物所含的官能团。红外光谱具有高度的特征性，不但可以用来研究分子的结构和化学键，如力常数的测定等，而且广泛地用于表征和鉴别各种化学物种。2019/12/2111南京农业大学生命科学学院2019/12/2111南京农业大学生命科学学院第二节红外光谱仪器类型与结构使用的光谱有两种类型：一种是单通道或多通道测量的棱镜或光栅色散型光谱仪，另一种是利用双光束干涉原理并进行干涉图的傅里叶变换数学处理的非色散型的傅里叶变换红外光谱仪。现代红外光谱议是以傅立叶变换为基础的仪器。该类仪器不用棱镜或者光栅分光，而是用干涉仪得到干涉图，采用傅立叶变换将以时间为变量的干涉图变换为以频率为变量的光谱图。傅立叶红外光谱仪的产生是一次革命性的飞跃。与传统的仪器相比，傅立叶红外光谱仪具有快速、高信噪比和高分辨率等特点。2019/12/2112南京农业大学生命科学学院2019/12/2112南京农业大学生命科学学院第二节红外光谱红外光谱示意图：2019/12/2113南京农业大学生命科学学院2019/12/2113南京农业大学生命科学学院第三节质谱质谱分析法是将不同质量的离子按质荷比（m/z）的大小顺序收集和记录下来，得到质谱图，用质谱图进行定性、定量分析及结构分析的方法。质谱分析法是物理分析法，早期主要用于相对原子质量的测定和某些复杂化合物的鉴定和结构分析。2019/12/2114南京农业大学生命科学学院随着GC和HPLC等仪器和质谱仪联机成功以及计算机的飞速发展，使得质谱法成为分析、鉴定复杂混合物的最有效工具。2019/12/2114南京农业大学生命科学学院第三节质谱突出特点（与核磁、红外、紫外相比）:质谱法是唯一可以确定分子质量的方法灵敏度高，样品用量少通常只需微克级样品，检出限可达10-14g应用范围广质谱仪种类很多，应用范围广，可进行同位素分析、化学分析、无机成分分析、有机结构分析被分析对象：气体、液体、固体2019/12/2115南京农业大学生命科学学院2019/12/2115南京农业大学生命科学学院第三节质谱基本原理:质谱法一般采用高速电子来撞击气态分子，将电离后的正离子加速导入质量分析器，然后按质荷比（m/z）的大小顺序进行收集和记录，得到质谱图，根据质谱峰的位置进行定性和结构分析，根据峰的强度进行定量分析。2019/12/2116南京农业大学生命科学学院气态分子高速电子撞击正离子加速导入质量分析器按m/z的大小收集质谱图峰位置定性定结构峰强度定量分析2019/12/2116南京农业大学生命科学学院第三节质谱质谱分析仪结构示意图2019/12/2117南京农业大学生命科学学院质量分析器离子源分子分离器2019/12/2117南京农业大学生命科学学院第三节质谱质谱分析仪的组成：质谱仪主要包括六部分：真空系统进样系统离子源质量分析器离子检测器计算机自动控制和数据处理系统2019/12/2118南京农业大学生命科学学院2019/12/2118南京农业大学生命科学学院第三节质谱质谱分析仪的组成：高真空系统在质谱分析中，为了降低背景以及减少离子间或离子与分子间的碰撞，离子源、质量分析器及检测器必须处于高真空状态。离子源（10-4~10-5）质量分析器（10-6Pa）。进样系统进样系统作用是将待测物质（试样）送进离子源。一般有：直接进样——高沸点的试液、固体试样可用探针或直接进样器送入离子源，调节温度使试样气化间接进样——一般气体或易挥发试样色谱进样——色谱-质谱联用仪器中，经色谱分离的组分通过接口元件直接导入离子源。2019/12/2119南京农业大学生命科学学院2019/12/2119南京农业大学生命科学学院质谱分析仪的组成：离子源其作用使样品离子化，并使离子汇聚成具有一定形状和能量的离子束。它是质谱仪的心脏。离子源的结构和性质对质谱仪的分辨率、灵敏度影响很大。使物质电离的方法很多：电子轰击，化学电离、火花电离、ICP离子源等。质量分析器作用是将离子源产生的离子按质荷比m/z大小分离，使符合条件的离子飞过分析器，过滤掉不符合条件的离子。常见的有单聚焦质量分析器，双聚焦质量分析器和四极滤质器等。离子检测器和记录系统经质量分析器分离的离子，到达检测器进行接受检测，经放大器放大后，由记录仪记录下来。常用离子检测器：静电式电子倍增器、法拉第筒接受器、照相版和闪烁计数器等。2019/12/2120南京农业大学生命科学学院2019/12/2120南京农业大学生命科学学院第三节质谱质谱图以质荷比m/z为横坐标，离子相对强度为纵坐标，相对强度是把原始质谱图上最强的离子峰定为基峰，规定其相对强度为100%，其它离子峰以对基峰的相对百分值表示，由质谱图很直观地观察整个分子的质谱信息。2019/12/2121南京农业大学生命科学学院2019/12/2121南京农业大学生命科学学院第三节质谱质谱图2019/12/2122南京农业大学生命科学学院2019/12/2122南京农业大学生命科学学院第三节质谱气质联用（GC-MS）气质联用是对气相色谱-质谱联用技术的简称，是将气相色谱仪器（GC）与质谱仪（MS）通过适当接口相结合，借助计算机技术，进行联用分析的技术。GC-MS是最成熟的两谱联用技术。2019/12/2123南京农业大学生命科学学院2019/12/2123南京农业大学生命科学学院第三节质谱气质联用（GC-MS）气质联用仪由GC、MS和接口三部分组成。其中前两部分原理与单独的仪器相同。GC-MS的接口：由GC出来的样品通过接口进入到质谱仪，接口是色质联用系统的关键。接口作用：压力匹配——质谱离子源的真空度在10-3Pa，而GC色谱柱出口压力高达105Pa，接口的作用就是要使两者压力匹配。组分浓缩——从GC色谱柱流出的气体中有大量载气，接口的作用是排除载气，使被测物浓缩后进入离子源。常见接口技术有：分子分离器连接（主要用于填充柱）；直接连接法（主要用于毛细管柱）；开口分流连接（放空一部分色谱流出物，让另一部分进入质谱仪。此法样品利用率低。）2019/12/2124南京农业大学生命科学学院2019/12/2124南京农业大学生命科学学院2019/12/2125南京农业大学生命科学学院气质联用仪气质联用基本原理第四节核磁共振核磁共振（NMR）核磁共振谱技术，是将核磁共振现象应用于分子结构测定的一项技术。在外加磁场的作用下，原子核的自旋方向达到一致，可以和一定频率的外加磁场共振而形成吸收峰，同一种原子核在分子中的位置不同，因其外围的电子云对核的屏蔽作用引起的吸收峰位置移动（化学位移）也不同，由吸收峰的位置可以推断原子处于哪一个基团。在1H-NMR谱中，当相邻基团上有n个质子时，该基团的质子吸收峰将分裂成n+1个峰。核中电子运动产生磁场是吸收光谱的另一种形式。在适宜的条件下样品能吸收射频区的频率，所吸收的电磁频率