生物化学综合实验习题解答

生物化学综合实验习题解答综合实验一蛋白质的浓度测定—Bradford法1．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？答：(1)由于蛋白与考马斯亮蓝G-250染料的结合能力不同，纵向倒转混合，充分反应。(2)标准蛋白加入的量与考马斯亮蓝G-250的体积相差悬殊，纵向倒转混合，充分反应。2．查阅相关资料、文献，举例说明测定蛋白质的浓度的方法有哪几种，并说明各自的优缺点。答：主要的以下几种：（1）微量凯氏（Kjeldahl）定氮法，优点是测定准确率高，可测定不同形态的样品。缺点是测定过程繁琐。（2）双缩脲法（Biuret法）优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（３）Folin—酚试剂法（Lowry法）此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。(４）考马斯亮兰法（Bradford法）考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在波长为595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。优点：a.灵敏度高。b测定快速、简便，只需加一种试剂。c.干扰物质少。缺点：a由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。b.物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。c.标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。综合实验二（1）酸性磷酸酯酶的提取1、酸性磷酸酯酶在生物体内的作用是什么？答：酸性磷酸酯酶(AcidPhosphatase，E.C.3.1.3.2)存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键，如水解磷酸苯二钠生成苯酚和无机磷。综合实验二（2）酶促反应进程曲线的制作和初速度的测定1、为什么酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行？答：要进行酶的活力测定，首先要确定酶的反应时间。酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度范围内进行选择。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。反应时间延长以后底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强。因此，要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶反应时间成正比这一段时间内进行初速度的测定。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。综合实验二(3)酶的活力测定1、酶活力测定中为什么各样品与底物测定的时间要严格一致？答：本实验中用磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解以后即生成酚和无机磷，其反应式如下：O||C6H6-O-P-ONa+H2O≒C6H6-OH+Na2HPO4|ONa由上式可见，当有足够量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的产物酚和无机磷也越多。反应速率只在反应的最初一段时间范围内保持恒定。随着时间的延长，底物浓度的降低和产物浓度的升高，使逆反应加强。综合实验二(4)酸性磷酸酯酶分子量的测定SDS-PAGE电泳法1、为什么要在样品中加少许溴酚兰和一定浓度的甘油溶液？甘油及溴酚兰的作用分别是什么？答：加少许溴酚兰的目的是作指示剂，用来反映在电泳的过程中样品蛋白质迁移的长度。加入甘油的作用是甘油的密度较大，对样品中的蛋白质起沉淀作用。2、影响迁移率的因素有哪些？答：①SDS的浓度，溶液中的SDS的总量至少要比蛋白质的量要高三倍，一般高达10倍以上。②溶液的离子强度，溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，在低离子浓度中SDS单体具有较高的平衡浓度。③二硫键是否完全被还原，只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的条件下才能准确测定。在有些情况下，还需要进一步将形成的巯基烷基化。④每次样品测定必须同时做标准曲线，而不得利用另一块电泳的标准曲线。综合实验三动物组织DNA提取及纯度检测1、DNA提取的原理是什么？答：真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，提取DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离和保持DNA分子的完整。提取DNA过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿或异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。2、试分析DNA样品不纯的原因？答:①裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解，②各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解，③取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰，④异丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。综合实验四大肠杆菌感受态细胞制备及外源DNA的转化1、氨苄青霉素筛选转化子的原理是什么？答：外源DNA转化是以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。2、影响转化的因素有哪些？答：(1）细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，密度过高或不足均会影响转化效率。（2）质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。（3）试剂的质量:所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。（4）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。