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《生物农药》实验指导书金晨钟主编谭显胜湖南人文科技学院生命科学系农学教研室2011年9月前言生物农药（biopesticides），按照Copping和Menn的定义包含活体微生物（病毒、细菌、真菌），昆虫致病线虫，植物源农药，微生物农药，微生物次生代谢物质（抗生素），昆虫信息素，用于表达抗虫、抗病、抗病毒、耐除草剂的基因以及昆虫天敌。生物农药的独特优点是对人类健康威胁小，对环境安全。这正是全社会最关心的问题之一。进入21世纪以来，各国政府和民众更加重视生物农药的开发和应用，生物农药在整个农药市场的份额正在逐年上升。我国的天然药物资源十分丰富，为了发现新的活性成分，寻找新的药物，就必须首先从复杂的药物成分中提取出有活性的单体成分，以期为新农药合成提供先导化合物。因此，正确掌握提取分离的实验操作以及熟悉快速、有效的新的提取分离技术在分离目的化合物中就显得尤为重要。本实验指导书书共分三部分。第一部分是有效成分的提取。内容主要包括溶剂提取法（回流提取、索氏提取）和水蒸气蒸馏法，重点介绍了溶剂提取法的原理和如何选择溶剂，要求掌握回流提取、索氏提取装置和水流气蒸馏装置的正确应用。第二部分主要介绍有效成分的初步分离及其化学成分预测试。内容主要包括薄层层析分离法和有效成分化学预试验方法，要求掌握薄层层析板的制备和正确应用各种分离方法。第三部分是有效成分的生物测定。内容包括生物杀虫剂的生物测定方法（为了突出与化学农药的区别，这里主要介绍驱避、拒食等作用方式的测定方法）、生物农药杀菌剂生物测定方法（孢子萌发法和生长速率测定法）、生物农药抗植物病毒剂（以抗烟草花叶病毒TMV为例）和生物农药除草剂生物测定方法。生物农药是一门专业性很强的学科交叉课程，学好生物农药，需要同时具备农学、生物学和化学等方面的知识。根据此门课程的特点，结合本科生教学特点的需要，我们编写了此实验指导书。编者2011年9月实验须知一、牢固树立“安全第一”的思想1、实验前应充分预习实验内容，了解实验所用药品的性能及危害和注意事项。2、实验进行时应该注意仪器是否完好无损，装置力求正确稳妥，严格遵守操作规程及实验条件，未经指导老师允许不得擅自改变。3、保持台面整齐清洁，不得将与实验无关的仪器、书籍、杂物等堆放在实验台上。4、禁止在实验室吸烟、饮水或吃东西。不得在实验过程中看其它书籍、听广播、玩手机、大声说笑、会客等与实验无关的活动。5、易燃、易挥发物品不得放在敞口容器中加热。6、实验进行当中不得擅自离开操作台，如必须暂时离开，应托付他人照看。7、废酸、废渣、废纸等均应倒入废液缸中，不得倒入水槽。8、要熟悉安全用具如灭火器、砂桶等的放置地点及使用方法。9、最后离开实验室者应负责检查实验室的水、电、门、窗、通风设备是否关好。二、事故的预防和急救1、爆炸和火灾（1）易燃气体或易燃溶剂的蒸汽在空气中混合到一定比例时，遇到明火、电火花、静电摩擦都会引起爆炸。因此，实验中要有良好的通风；倾倒和量取易燃液体均应在通风橱内进行，远离火源；不得用敞口容器加热、盛装、或蒸除有机溶剂；冷凝水要保持畅通；或进行搅拌或加入沸。（2）仪器内压力过高造成爆炸。常压操作时，应使全套装置通大气，切勿造成密闭体系；减压蒸馏时，要用圆底烧瓶作接受器，不可用锥形瓶。如一旦发生火灾，切不可惊慌失措，应保持冷静，采取措施灭火立即报告指导教师，切断电源，选择适当的灭火器材。2、中毒许多化学溶剂都有不同程度的毒性，溅入口中立即用大量水冲洗。腐蚀性毒物：对于强酸，先用大量水冲洗，然后服用氢氧化钠铝膏、鸡蛋白；对于强碱也应先用大量的水，然后服用醋、酸果汁、鸡蛋白。刺激性及神经性毒物：先给牛奶或鸡蛋白冲淡，再给如硫酸镁催吐，立即送医院。3、外伤与急救割伤：发生原因通常都是因玻璃折断所伤。一旦割伤，用蒸馏水洗净伤口，贴上创可贴或涂上红药水。烫伤或被火烧伤：轻伤可用苦味酸饱和溶液洗涤后涂以硼酸、凡士林或烫伤膏。化学试剂灼伤：皮肤被酸或碱灼伤，先用大量水冲洗，然后分别用3%碳酸氢钠或硼酸溶液洗涤。4、安全用电使用电器时，应防止人体和电器导电部位接触，不能用湿手接触电源插头；如发现仪器有漏电，打火花等现象时，立即断开电源进行检修。实验结束后，应及时断开电源。目录实验一生物农药中有效成分提取之溶剂提取法——索氏提取.....2实验二生物农药中有效成分提取之溶剂提取法——回流提取.......4实验三生物农药中有效成分的提取方法——水蒸气蒸馏法..........6实验四生物农药有效成分的分离——萃取法（LLE）.................9实验五生物农药有效成分的分离——薄层层析法（TLC）............11实验六植物提取物化学成分预试验.............................13实验七用薄层层析法测定蔬菜中生物农药的残留量...............16实验八生物杀虫剂对小菜蛾的毒力测定.........................20实验九生物杀虫剂对韭菜迟眼蕈蚊幼虫的毒力测定...............22实验十生物杀虫剂对害虫的取食忌避和非选择性拒食作用测定.....23实验十一生物杀菌剂的生物测定——孢子萌发法.................24实验十二生物杀菌剂生物测定——生长速率法...................26实验十三生物农药抗烟草花叶病毒（TMV）活性测定...............29实验十四生物除草剂对黄瓜种苗的活性测定.....................32附录1有效成分鉴别常用显色剂及其配制.......................33附录2《生物农药》课程相关的主要参考书目.....................45附录3学习农药专业知识的相关期刊、数据库和网站..............47实验一植物源农药——细辛提取物的提取及药效观察随着人们环保意识逐渐提高，对无公害蔬菜的需求越来越大。植物中含有很多天然的化学成分，我国利用植物材料治疗人类疾病已经有几千年的历史了。依据中医药研究的成果，在低毒或无毒的植物材料中筛选对植物病原真菌具有抑制或杀灭作用的材料为寻找新的化学结构提供了一条新的线索。1、目的要求掌握植物源农药——细辛提取物的提取原理、加工工艺以及测试方法。2、方法原理乙醇作为对细辛的适宜提取溶剂，利用恒温振荡提取法提取。主要实验仪器及材料细辛200g手提式中药粉碎机1台恒温振荡仪1台80%的乙醇500mL50%的乙醇500mL离心机1台烘箱1台试管5根烧杯4个玻璃棒2根纱布1卷电子天平1台冰箱1台培养箱1台4、掌握要点细辛的前期处理工作及提取工艺、测试程序。5、实验内容5.1细辛提取物的制备取经粉碎的植物材料20g，加80％乙醇100mL，30℃，l50r／min恒温振荡提取2d。三层纱布过滤，滤液经4500r／min离心20min。取上清液45℃下减压浓缩。残余物用50％乙醇重新溶解并定容到20mL，4℃下保存。5.2杀菌活性验证将细辛提取物配置成5个浓度备用（0.25g/L,0.50g/L,1.00g/L,2.00g/L,4.00g/L）→制备浓度为100个左右/L镰刀菌孢子悬浮液备用→将5个浓度的细辛药液各取1ml分别与镰刀菌孢子悬浮液混匀→吸取一滴置于凹玻片中，放在保湿器培养（25-28℃）→8h后观察孢子萌发情况6、注意事项、结果计算与分析实验二植物源农药——黄连中生物碱的提取及药效观察黄连是著名的中药，其根、茎味极苦，苦味在于其所含的多种生物碱。黄连中生物碱具有泻火、燥湿、解毒、杀虫等作用，多用于治疗细菌性痢疾、肺结核等疾病，对猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道、妇科及外科感染也有一定疗效。1、目的要求掌握植物源农药——黄连中生物碱的提取工艺。2、方法原理微波辅助提取：利用微波的反射、穿透、吸收、热效应和渗透速度快等特点，将药物组织和细胞中的生理活性物质提取出来，微波辅助提取可以显著提高目标成分的提取量，减少对提取溶剂的限制，达到强化与优化传热传质的目的。3、主要实验仪器及材料黄连200g手提式中药粉碎机1台微波炉1台稀硫酸（0.092mol／L）500mL40目的筛子1个电子天平1台纱布1卷试管5根烧杯4个玻璃棒2根冰箱1台培养箱1台4、掌握要点黄连的微波处理提取工艺及提取物活性测试方法。5、实验内容5.1称取黄连20g，采用中药粉碎机粉碎，过4O目筛，称取黄连粉1.0g，加人90mL0．015mol／L的硫酸溶液浸湿，在微波中采用中低火条件下，间歇加热5min后，三层纱布过滤，烘干，备用。5.2杀虫活性测试将生物碱提取物配置成3个浓度（稀释100倍，500倍，1000倍）并设置空白对照备用→选取龄期一致的蚜虫30头放置于寄主植物叶片上，置于塑料培养皿内，准备4次重复→将叶片分别置于生物碱药液及空白对照液中充分浸润5s后，将叶片置于棉花上自然晾干→24h后观察虫体存活情况。6、注意事项、结果计算与分析试验三蔬菜叶片中农药残留量的测定目前有机磷、氨基甲酸酯类农药是我国大量使用的杀虫剂，虽然这类农药与过去使用的有机氯农药相比，降解速度较快，但在果蔬中的残留仍然较为严重。由于该类农药能抑制人体内乙酰胆碱酯酶的生理活性，神经传导因此受阻，引起神经麻痹乃至死亡，对人类健康造成极大危害。对于果蔬中的农药通常采用气相色谱等方法进行分析，但分析时间长，操作步骤烦琐，适用于实验室分析。长期以来在大部分果蔬市场中，通常采用乙酰胆碱酯酶抑制法进行快速检测，即以乙酰胆碱酯酶作为检测试剂，采用农药残留检测仪，根据乙酰胆碱酯酶活性变化的程度来测定果蔬样品中的残留农药。1、实验目的1.1．了解果蔬中残留农药的分析方法；1.2．掌握酶抑制分析方法的原理及操作方法；1.3．理解农药残留性评价的意义。2、实验原理有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，酶抑制法就是根据这一昆虫毒理学原理，对农药残留进行检测。以乙酰胆碱为底物，在乙酰胆碱酯酶（ACHE）的作用下，乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱和二硫双对硝基苯甲酸（DNTB）产生显色反应，使反应液呈黄色（于410nm处有最大吸收峰）。根据酶促反应动力学原理，在没有有机磷和氨基甲酸酯类农药存在时，底物在酶的催化作用下发生水解，反应速率可以用吸光度值随时间的变化率K0来表示。当有机磷和氨基甲酸酯类农药加入到酶的显色体系中时，农药抑制了酶的活性，影响显色体系的反应速度，此时体系吸光度随时间的变化率为Kt，则有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的活性的抑制率Y的计算公式如下：%10000KKKYt。采用乙酰胆碱酯酶测定残留农药时，当酶完全水解底物乙酰胆碱时，溶液显黄色，其抑制率为0％，当酶活性被农药抑制而部分水解乙酰胆碱，测定溶液显淡黄色，出现相应的抑制率，当酶完全被农药抑制，测定溶液显无色，抑制率为100%，这样就可以建立起农药残留量与酶活性抑制率之间的关系。因而可以通过测定抑制率的大小来显示农药残留的毒性程度。样品的毒性等级分为：安全、低毒和高毒。3、仪器和试剂3.1．仪器CL-BIII四通道残留农药测定仪1台天平（0.01g）1台一次性手套1双金属镊子1支1000ml玻璃瓶1个移液枪（50-250μL）1套剪刀1把3.2．试剂提取液：把提取液甲乙粉末倒入大玻璃瓶中，并加510ml蒸馏水溶解。酶试剂(乙酰胆碱酯酶)：用移液枪取3.1ml提取液，加入酶试剂瓶中。显色剂(二硫代硝基苯甲酸)：用移液枪取20ml提取液，加入显色剂瓶，溶解后倒入棕色瓶中。底物(乙酰胆碱)：用移液枪取3.1ml蒸馏水，加入底物瓶中。4、实验步骤4.1仪器连接将CL-BIII四通道残留农药测定仪连接电源，把RS232/RS485的转换器接入电脑主机背后的COM口（串口）上，然后把数据信号线与转换器连接上，这样就完成了仪器与电脑的硬件连接。4.2检测操作把“农产品质量安全检测软件”光盘放入电脑光驱中，等自动读取或在光盘目录下找到并双击“setup”后