生物大分子分离技术综述

生物大分子分离技术综述摘要：生物大分子包括核酸DNA和RNA、多糖、酶、蛋白质以及多肽等。生物大分子分离技术是生物研究中的核心技术之一，当前医学，药学及生命科学学科之间的交叉渗透为大分子分离技术的发展提供了更多的契机。本文对以沉淀、透析、超滤和溶剂萃取为代表的传统分离技术,以及色谱,电泳等现代分离技术的发展概况、方法、特点及应用进行了综述。关键字：分离技术生物大分子1前言生命科学的发展给生物大分子的分离技术提出了新的要求。各种生化、分子研究要求提取分离高纯度，结构完整和具有生物活性的活性的生物大分子样品，这就使得分离技术在各项研究中起着至关重要的作用。对生物大分子分离技术的研究也就随之产生。同时，随着各学科之间的交叉渗透，纳米材料、计算机自动化等技术的发展也为生物大分子技术的发展提供了更多的空间。生物大分子的制备具有如下特点：生物样品的组成极其复杂，许多生物大分子在生物样品中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，耗时长；许多生物大分子在分离过程中就非常容易失活，因此分离过程中如何保证生物大分子的活性，也是提取制备的困难之处；生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、PH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。这些都要求生物大分子的分离技术以此为依据，突破这些难点，优化分离程序以获得符合要求的生物大分子试剂。2传统分离技术被广泛应用传统的生物大分子分离方法有透析、溶剂萃取、沉淀和超滤等，它们都是一些较早就建立起来比较完善的的分离方法。2.1透析法1861年ThomasGraham发明透析方法,已成为生物化学实验中最简易常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的分离过程中,除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品等都需用到透析。现在，除半透膜的材料更加多样化，透析方式也更加多样。透析法主要是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化DNA、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制：透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小，要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。分离时，加入欲透析的样品溶液，悬挂在纯化水容器中，经常更换水加大膜内外溶液浓度压，必要时适当加热，并加以搅拌，以利透析更快。最后，透析是否完全，须对透析膜内溶液进行检测。2.2溶剂萃取法溶剂萃取法是在20世纪40年代兴起的一项化工分离技术，很被快应用到了生物分子的纯化和分离上。基本原理是用一种溶剂将产物自另一种溶剂中提取出来以达到浓缩和提纯的目的。最初是用于抗生素有机酸，维生素等生物小分子的提取，最近几十年来随着与其它技术的结合而产生了一系列新的分离技术，如超临界萃取、逆胶束萃取、液膜萃取等，可以用于生物大分子如核酸、蛋白质、生物碱等的提取和纯化。在液体混合物溶液中加入某种溶剂，使溶液中的组分得到全部或部分分离的过程称为萃取，溶剂萃取法是从稀溶液中提取物质的一种有效方法[2]。2.3沉淀法沉淀法是利用沉淀反应，将被测组分转化为难溶物，以沉淀形式从溶液中分离出来，并转化为称量过程，称定其重量进行检测的方法。利用盐析法将蛋白质沉淀出来的方法由来已久。其基本原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加。球蛋白当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响。有机溶剂对于许多蛋白质、核酸、多糖和小分子生化物质都能产生沉淀作用。优点是其分辨度比盐析法高，溶剂容易除去且可回收，沉淀的蛋白质不需要脱盐。而缺点是有机溶剂易使蛋白质变性，经常采用降低温度的方法进行控制，且有机试剂用量大，回收、储存都较麻烦。2.4超滤法超滤技术是一种加压膜分离技术。20世纪20年代问世，至60年代以来其发展迅速，很快由实验室级的分离技术发展成重要的工业级操作技术。超滤作为一种高效分离技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子的脱盐、浓缩和分级分离。基本原理以超滤膜筛为中介，膜两侧的压力差为动力，当原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。优点是超滤技术分离效率高，对稀溶液中的微量成分的回收、低浓度溶液的浓缩均非常有效。其局限性是不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50%的浓度。3.现代分离技术3.1电泳技术带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis,EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。1937年瑞典学者A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。目前所采用的电泳方法,大致可分为3类:显微电泳,自由界面电泳和区带电泳。随着电泳支持物的改进，电泳条件的完善，区带电泳、等电聚焦电泳、双向电泳等技术逐渐建立起来，同时，在电泳模式上也有了极大的发展，先后出现了圆盘电泳、垂直板电泳、柱状(管状)电泳等，电泳分辨率也随之得到提高。目前应用最为广泛的有醋酸纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向凝胶电泳技术等。3.1.1醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳，与纸电泳相似，只是换用了醋酸纤维薄膜作为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.1~0.15mm。由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术[3]。3.1.2SDS—PAGE在聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上添加去污剂十二烷基硫酸钠(简称SDS)．蛋白质因为与SDS结合而带有大量电荷。从而消除蛋白质原有的电荷量差别，其泳动速度便主要和分子大小有关。这种SDS-聚丙酰胺电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度柱测和测定蛋白质分子量。SDS—PAGE应用于提纯过程中纯度的检测．纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带。但如果蛋白质是由不同的亚基组成的．它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS—PAGE具有较高的灵敏度．一般只需要不到微克级的蛋白质，而且通过电泳还可以获得关于分子量的情况[4]。3.1.3双向凝胶电泳双向凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技术又称二维凝胶电泳技术，是目前常用的唯一一种能够连续地在一块胶上分离数千种蛋白质的方法，第一，采用等电聚集电泳。第二，采用了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。广泛应用于生物学研究的各个领域，其原理是将高分辨率的等电聚集电泳和SDS-PAGE电泳联合组成双向电泳。3.1.4电泳与其他联用技术毛细管电泳时带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中接其淌度或分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳。其分离模式有：毛细管区带电泳、胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等点聚焦，毛细管电色谱。毛细管电棘(EE)作为一种分离技术与质谱(MS)联用作为一种检测方法，在食品分析领域具有重要优势，因为它结合了毛细管电泳的强分离能力以及质谱在定性和确证方面的强大功能。近来，许多有关多维毛细管电泳分离技术的设想已被提出有些还得到了初步的尝试，其分离的优势也得到人们的关注。与传统的分离方法相比，CE具有分离效率高、分析速度快、样品及试剂用量少等特点，使其成为极为有效的分离技术，广泛应用于分离蛋白质、糖类、核酸等物质[5]。毛细管电色谱是将常规色谱填料填充到毛细管中,或在毛细管内表面键合、涂敷固定相,以电渗流作为流动相的推动力,根据样品中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异和在电场中迁移速率的不同而实现分离的一种高效微分离技术。近年来CEC在分离分析生物大分子中应用较为广泛。不少研究工作者开始将研究方向转移到CEC分离分析生物大分子。如CEC结合了CE的高效性和HPLC的高选择性,是一种新型的微柱分离分析技术[7],已成为蛋白质等生物大分子分离分析的方法,它的出现为蛋白质的分离分析提供了一条新的有效途径[8]。但目前CEC主要是以电驱动流动相为分离模式,操作中易产生气泡,使其受到很大的限制。加压毛细管电色谱(PEC)的出现解决了长期限制CEC广泛使用的问题,PEC克服了仅靠电渗流驱动的一些限制因素,可方便地对流动相组成、性质、流速进行调节,抑制气泡的形成,尤其能实现梯度洗脱,是CEC发展的重要方向[9]。3.2色谱技术色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。色谱被认为是迄今人类掌握的对复杂混合物分离能力最强的手段。特别是液相色谱，大都在室温条件下进行；所有的流动相可以是与生理液相似的具有一定pH值的含盐的缓冲水溶液，有时也使用某些能与水互溶的有机溶剂；所用填料的表面经过了各种相应的化学修饰和覆盖，这样就为生物大分子的分离提供了温和的条件和软接触表面，有利于它们保持原有的构象和生理活性。所以液相层析作为生物大分子的分离重要方法具有很大的发展前景。据分离机制不同，液相色谱可分四大基础类型：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、凝胶色谱，可根据生物大分子结构、生物活性、分子量大小等性质不同，选择不同的分离纯化模式。多维液相色谱法是利用两根或多根性质不同的色谱柱，通过一定的接口和切换技术对不同色谱分离模式的结合，或一根色谱柱内通过填充不同分离模式的色谱填料，完成对复杂样品的待分析组分进行分离。多位液相色谱具有分离样品动态范围宽、分辨率高、分析速度快、自动化程度高等优点。近几年来，多维液相色谱分离模式在蛋白质组学和生物制药领域得到了很广泛的应用。亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。亲和色谱的显著特点：具有其他分离技术所不能比拟的高选择性，且色谱过程操作条件温和，能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性，活性样品的回收率也比较高。所以亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。特别是对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效，经一步亲和色谱即可提纯几百至几千倍。亲和膜色谱亲和膜色谱以膜为亲和载体，偶联亲和配基，选择性地吸收目标物质。亲和膜色谱是在亲和色谱的基础上发展起来的，是现代膜分离技术与亲和色谱技术的结合。径向色谱技术是最有效的复杂样品快速分离、制备工具之一，尤其在生物样品的制备、复杂样品的初分离等方面与传统轴向液相色谱相比具有明显的优势。该技术的发展可以追溯到60年前，1947年，Hopf发明了一种通过离心力分离液体溶液的装置，在大规模制备分离方面得到很好的应用[10]。1972年，Heftmann[11]将这种液体分离器的尺寸减小，转速增加到1950r／rain，分离效率得到较大提高。带有填充颗粒床的径向流离心分离器最早应用于化学反应器，后来也被收入到分析化学中。Saxena[12]等在美国专利“径向薄层色谱”中，对径向色谱技术的特点、操作及原理进行了阐述；Rice[13]等搁采用特殊设计解决了流体在床层中的分布问题，使径向色谱在上样量、分离速度等诸多方面的优势明显地表现出来，推动了径向色谱的实用化进程，真正使径向色谱走向产业化。随着生物工程技术研究的不断深入，径向色谱的应用前景非常广阔。采用径向色谱技术对蛋