生物大分子的分离纯化技术.

生物大分子的分离纯化技术生物样品的特点:生物活性复杂性内容:生物样品的常规分离纯化方法临床及生化分析样品的预处理生物大分子的电泳分离纯化技术生物大分子的色谱分离纯化技术生物样品的常规分离纯化方法透析微过滤盐析冷冻干燥离心透析基本原理透析膜:材料:火棉胶(Collodion),玻璃纸(Cellophane),纤维素(Cellulose)纤维透析管的处理:1%乙酸水溶液1h,碱性EDTA(1%Na2CO3,1mMEDTA)煮1h,纯水清洗,保存.透析液:水,缓冲液,高分子的浓溶液Donnan效应:pH变化(勤换透析液,使用大量的透析液)Donnan效应:微过滤的类型:深层滤器(DepthFilter):滤膜滤器(ScreenFilter):纤维素醋酸酯(硝酸酯)微过滤技术的应用:溶液的澄清微量沉淀物的收集细菌细胞的收集微过滤盐析基本原理：在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度不断降低而沉淀析出，即盐析。盐析实验应注意的问题：盐类的选择：硫酸铵（767g/l,25℃)盐的饱和度：温度：室温或4℃pH：等电点蛋白质的浓度：冷冻干燥基本原理：又称升华干燥，是在低温、副压下进行干燥的方法。冷冻干燥的条件：温度，-10~-40℃；真空度，13~40Pa。离心基本原理种类：普通离心机（6000rpm)，高速离心机(25000rpm)，超速离心机转子：固定角度式，悬挂吊桶式离心(2)离心力和相对离心力(Relativecentrifugalforce)：F=mω2r;Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r沉淀速度与沉降系数：F摩擦=fvF净=(Mp-Ms)ω2r-fv沉降系数：沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度），蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的范围.以1×10-13s为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.离心(3)离心技术的类型：最大速度方法：移动界面（MovingBoundary)超速离心法移动区带(MovingZone)超速离心法等密度方法(Iso-density)：临床及生化分析样品的预处理样品的类型、采集与保存酶样品的准备样品的类型、采集与保存样品的类型：样品的类型、采集与保存样品的采集血样：全血：肝素抗凝（0.02~0.2mg/ml)血浆：2000g离心10min血细胞：血清：5~30min自凝分离尿样：酸式采集（HCl或硼酸，pH2.5)，碱式采集(碳酸钠，几滴苯酚抗菌）唾液：组织样品：液氮等冷冻酶样品的准备酶活性的保持控制纯化过程中的pH、温度及有机试剂加入载体蛋白防止酶的吸附，如:BSA加入辅助因子保护活性部位,如:EDTA,巯基乙醇，谷胱甘肽抑制蛋白酶的水解作用，如:氟代磷酸二异丙酯，甲（乙）酰-亮-亮-精三肽等亲水分子稳定剂，如甘油，糖醇等样品制备从组织或器官制备样品从组织或器官培养液中制备样品从生物体液中制备样品（5000rpm,15min)从细胞培养液制备样品电泳分离纯化技术聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳高效毛细管电泳电泳分离纯化技术基本原理V=μeE(μe为电泳迁移率,即电场强度为1V/cm时的迁移速率.)影响电泳分离的因素:物质本身的结构和性质:荷电性质,形状支持介质:吸附作用,电渗作用溶液介质:pH,离子强度电场强度:常压500V聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶的结构和性质凝胶的机械强度、弹性、透明度和黏度等取决于凝胶的总浓度:聚丙烯酰胺凝胶电泳(2)凝胶电泳的装置柱型(ColumnGel):10cm×6cm板型(SlabGel):12cm×12cm或14cm×16cm;玻璃板间距1.75或1.5cm.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(盘状电泳)电荷效应浓缩效应分子筛效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量1%SDS+0.1M巯基乙醇分子量1.0×104~2.0×105蛋白质的等电聚焦(IsoelectricFocusing,IEF)原理pH梯度的形成与保持琼脂糖凝胶电泳特点：适合分子量大的分子；无毒；分辨率高；重复性好胶浓度：0.5%~3%；分离1~9.0×107DNA片段0.5~1.0%胶分离0.5~30kbDNA,1.0~1.5%胶分离小片段琼脂糖凝胶电泳的应用限制性核酸内切酶存在下酶切DNA片段的分析DNA超螺旋结构的鉴定DNA分子量的测定脉冲场凝胶电泳DNA分子量的测定高效毛细管电泳仪器毛细管:I.D,25~100μm;O.D.,100~400μm;L,0.1~1m进样系统:nL~pL,流体力学方法和电动进样高压直流电源：30kV,1~300μA检测紫外-可见吸收法荧光检测法电化学检测法质谱法高效毛细管电泳基本概念：电泳淌度电渗流分析参数：淌度和迁移时间分离效率分离度高效毛细管电泳分离模式毛细管区带电泳（CapillaryZoneElectrophoresis,CZE)毛细管胶束电泳（CapillaryMicellarElectrokineticChromatography,CEKC)毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophoresis,CGE)毛细管等电聚焦（CapillaryIsoelectricFocusing,CIEF)CGE的应用DNA序列分析蛋白质分析物理胶CZE生物大分子的色谱分离纯化技术排阻色谱亲和色谱离子交换色谱反相及疏水作用色谱液－液分配色谱亲和色谱固定相葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺－琼脂糖混合凝胶，（与凝胶色谱相似）配基：分离抗体用抗原，半抗原分离酶用底物，抑制剂，辅助因子等通用型配基，巯基丙基－琼脂糖含巯基配体亲和色谱分离原理亲和色谱配基与载体的结合琼脂糖的溴化氰活化法6-氨基己酸－琼脂糖和,1,6-己二胺－琼脂糖亲和层析的特点：层析柱短配基－与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合