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生物大分子药物研究开发前沿内容第一部分：生物大分子药物及其研发现状第二部分：生物大分子药物传递系统研究进展第五讲复习思考题•生物技术药物的研发关键环节有哪些？•生物技术药物的翻译后修饰方法有哪几种？•蛋白质、多肽药物载体型传递系统有哪些？•疫苗载体型传递系统有哪些？第一部分：生物大分子药物及其研发现状生物大分子药物及其现状生物药物：肽、蛋白质、抗体、核酸（基因）、疫苗、糖治疗剂、基于细胞或组织的治疗剂已批准的生物药物:超过250个，包括重组蛋白质、血液产品、单克隆抗体和重组疫苗药物应用最多的为重组蛋白质和抗体主要用于治疗癌症、艾滋病、冠心病、糖尿病和一些罕见的遗传疾病等。年销售额40亿美元的基因工程药物至2010年底，FDA共批准250种生物技术药物上市2007年销售额超过40亿美元的药物有16种，基因工程药物占据7种：1.治疗非霍奇金淋巴瘤的anti-CD20抗体Rituxan2.治疗乳腺癌的anti-EGFRII抗体Herceptin3.治疗肿瘤放化疗后出现的白细胞减少的G-CSF4.治疗肺癌、乳腺癌和结直肠癌的anti-VEGF抗体Avastin5.治疗类风湿关节炎的anti-TNFα抗体Enbrel、Remicade近三年主要生物技术药物销售额20151210.696.76.5271911.813.5117.67.433259.51812.58805101520253035MonoclonalAntibodiesVaccinesErythropoietinTNFBlockersInsulinInterferonHormones销售额（$,billion)200620072008生物制药发展迅速1982-2008年美国FDA批准的新生物产品年美国处于临床试验的生物技术药物按产品类型分类按适应症分类重组生物药物的研发过程各种天然存在的治疗蛋白质E.coli等微生物表达药效更强的蛋白质工程产品多种表达体系开发应用突变技术融合蛋白质表达定向进化基因渗入基因敲除活性提高稳定性增加半衰期增加免疫原性减少真核哺乳动物细胞为主一、生物技术药物的研发过程及关键环节药物的设计——药物的靶点及药物设计药物的生产——表达体系和质量控制药物的评估——药效和毒副作用（一）药物设计--药物靶点研究探讨致病分子机理，寻找合适的药物治疗新靶点单个靶点的多种生物学功能及精细调控单个靶点的多种存在形式:亚型个体化治疗，针对特异人群的靶向诊断试剂和治疗药物多个信号途径的相互作用：网络病理学从老药中寻找治疗疾病的新靶点：不明确靶点的老药有17%发现老药的新型治疗用途（二）生物药物的生产高效表达系统生产工艺质量控制生物制药的生产—表达系统原核表达真核表达表达系统大肠杆菌枯草杆菌青枯病产碱杆菌假单胞菌NPro自身蛋白酶融合技术，NAFT(山德士公司，新微生物表达系统)酵母丝状真菌昆虫/杆状病毒表达系统植物哺乳动物细胞表达系统转基因动物生物反应器FDA批准的生物技术药物表达系统6619810102030405060708090bacteriayeastmammal数量66,40%19,11%81,49%bacteriayeastmammalFDA批准的生物药物表达系统细菌酵母哺乳动物原核表达系统大肠杆菌E.coli—安全、经典的标准化表达系统成本低廉、工艺成熟、表达量高简单蛋白质药物生产不可或缺的表达系统2000年后，在欧美新药的研究中比例减少2005年至今美国FDA批准的重组蛋白质药物都是真核表达缺点：1.容易形成包涵体（寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构），须变复性处理，易造成活性下降或丧失；2.提取时需破碎细胞，往往会造成核酸、热原、内毒素或脂多糖的释放；3.不存在翻译后修饰作用，蛋白质产物不能糖基化；4.目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应真核表达系统--酵母酿酒酵母Saccharomycescerevisiae——应用最多限制：糖基化修饰中糖链结构和组成与天然糖蛋白相差甚远，不适用糖链极大影响生物活性的蛋白质(EPO、治疗性抗体等)哺乳动物细胞表达系统具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白整合稳定；具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，可以大规模生产美国FDA倾向在21世纪都采用真核表达系统生产蛋白质药物欧美生物制药哺乳动物细胞表达产品ExpresssionsystemsandtransformedhostsNumberMammaliancells,nonprimatehamster,Chineseovary(CHO)仓鼠50murinemyelomacells鼠科骨瘤11murinecellsother1Mammaliancells,primate灵长类monkeycells,diploid,kidney,orfetallung4Humancellshumancells,transformedwithEpstein-Barrvirustransformed1humancells,geneactivationbyTKT22humankidneycells,embryonic胚胎样1humancells,unspecified1现有的利用哺乳动物细胞表达的药物中有70%是以CHO表达生产的[RonaldA.Rader.ExpressionSystemsforProcessandProductImprovement.BioProcessInternationalJUNE2008]1.构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低2.某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化3.上游构建与下游分离纯化脱节4.重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下缺点：研究方向：1.发展新的强启动子和合适的增强子2.提高基因剂量的新途径3.选择载体-宿主的最优组合4.装配适合于cDNA高效表达的必要元件5.大规模培养条件和无血清及无蛋白培养条件的探索CHO细胞表达系统的不足和改进表达系统发展方向1.研发可表达复杂的真核基因的真核微生物系统或改造的原核微生物系统2.真核表达系统中糖基化系统的重构3.用作生物反应器的转基因动物系统——动物乳腺生物反应器利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。2006年6月，世界上第一个利用乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物—重组人抗凝血酶Ⅲ(ATryn)的上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会批准，2009年获得美国FDA批准上市。（三）生物药物的质量控制新的蛋白质纯度检测指标:化学修饰类型：脱氨基,二硫键错配,氧化存在状态:降解片段,二聚体,多聚体糖基化蛋白质错误折叠二、生物药物的药效和副作用改善A.基因工程改造：现有上市重组药物中基因改造率达30%以上B.翻译后修饰（一）生物药物的基因工程改造原则：改变蛋白结构，在不弱化其生物功能及产生新的抗原性基础上优化其药代动力学实例：Lispro:重组人胰岛素B28、B29之间颠换——聚体的可能性降低1/300，起速效作用ReFacto:重组凝血因子VIII为缺失突变体——血友病有较好的疗效注意：基因工程改变序列应非常谨慎，一些很小的变化可能导致蛋白构象的较大变化，诱发免疫反应（二）生物技术药物的翻译后修饰I.PEG修饰:聚乙二醇(polyethylene,PEG)共价修饰蛋白质II.糖基化修饰III.脂肪酸、白蛋白修饰IV.融合蛋白:不同蛋白的不同功能域通过基因工程手段构建成一个蛋白，具有双功能或新的功能I、生物药物的PEG修饰1.增加蛋白质的分子量，减少小分子蛋白药物被肾小管直接过滤清除作用2.作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，减少免疫原性，减少体内清除率3.保护蛋白质不易被蛋白酶水解4.提高溶解性、流动性，延长药物作用，减少毒副作用均有利于延长蛋白药物的半衰期已上市的PEG化蛋白药物PEG修饰前后体内半衰期比较II、生物药物的糖基化修饰蛋白糖基化是真核生物常见的蛋白质翻译后修饰过程三种形式:N-糖苷(N-glycan)、O-糖苷(O-gly2can)、糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)。蛋白质经糖基化修饰后产生数千种具有独特生物活性糖蛋白,参与机体生命活动。蛋白质的溶解性；生物活性；稳定性；免疫原性；蛋白药物的动力学作用有效改善在蛋白药物表面增加侧链长度—增加蛋白质稳定性，阻碍蛋白酶对蛋白药物的降解使蛋白药物分子量增大——减少了肾小球滤过率定点突变增加生物药物的糖基化水平糖基化提高生物药物稳定性糖基化-β-干扰素：热变性的敏感性降低糖基化-白细胞介素-5(IL-5)：热稳定性增加糖基化-rhEPO:在盐酸胍、加热和pH变化中比去糖基化rhEPO稳定糖基化-rhEPO:免受氧自由基损伤糖基化增加蛋白质药物的生物活性、减少免疫原性rhEPO糖基化修饰产物:血浆中的半衰期显著延长，体内活性大大增强，单次注射小鼠时，相当于30～40倍的非糖基化rhEPO活性瘦素加成糖类似物:治疗糖尿病小鼠疗效增加10倍，时间维持更长mpl配体加成N-连接糖类似物:明显改善小鼠中血小板生成量和持续时间IgG1糖基化:极大消弱抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性R05072759(GA101):第一个进入临床试验的人源化和糖基化CD20单抗，体内外研究疗效优于利妥昔单抗糖基化提高蛋白类药物的血浆半衰期EPO的33位和88位糖基化修饰:体内半衰期是未糖基化修饰的3倍（Amgen公司研制已上市）突变体TK-tPA:糖基化tPA-T103Q-296-299四等位基因替换--延长了体内清除时间，同时保持正常的凝血活性糖基化-IL-3:聚集在细胞外基质中--血浆半衰期提高了2倍糖基化提高蛋白质药物的靶向治疗作用葡萄糖脑苷脂酶(GBA)-甘露糖结合:靶向肝中的巨噬细胞唾液酸糖蛋白受体与含有末端半乳糖或氮乙酰半乳糖胺的糖蛋白结合:可作为组织特异性蛋白质靶向带有特异性靶向病毒复制位点糖基化干扰素:有可能减小其毒性III、脂肪酸、白蛋白修饰延长半衰期SOD-白蛋白：半衰期由5min提高至6h;超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)，白蛋白-GH：半衰期由5min提高至2～3h；生长激素insulindetemir：脂肪酸修饰后的长效胰岛素类似物，NovoNordisk公司研发，2004年5月在瑞士首次上市干扰素α-2b-白蛋白(Interferonalfa-2b-albumin,修饰的人白蛋白-干扰素，丙肝用药)：能延长干扰素的半衰期。IV、融合蛋白Enbrel(Amgen)：TNF受体和IgG的Fc片段的融合蛋白，含934个氨基酸残基，适应症为风湿性关节，1998年批准；OntakLigand：缺失细胞结合域的白喉毒素与IL-2的N端133个氨基酸残基的融合蛋白，适应症为皮肤T细胞淋巴瘤，1999年上市；AmeviveBiogenIdec——LEF-3的CD2与IgG的Fc片段的融合蛋白，适应症牛皮癣，2003年上市1.抗体药物具有高度特异性，是靶向治疗的基础2.目前批准上市27种抗体药物，临床转化率以及批准成功率都较高3.抗体药物生产条件复杂，不易受仿制的威胁4.已上市的抗体药物具有很高的市场回报率，大大刺激了投资1.抗体药物是大分子糖蛋白，结构复杂，不利储存，不能口服，进入体内5-7天才能到达靶位置;2.抗体药物研发费用较高，达10-18亿美元3.抗体药物单剂用量大，质量标准高，生产成本高昂，价格昂贵Avastin:单个病人年度费用高达4-6万美元三、抗体药物研发缺点:1.抗体自身的抗原性2.抗体靶抗原的不确定性3.针对不同表