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第七章反胶团萃取法谢虹2019/12/212第一节概述反胶团萃取随着基因工程和细胞工程的发展，尽管传统的分离方法(如溶剂萃取技术)已在抗生素等物质的生产中广泛应用，并显示出优良的分离性能，但它却难以应用于蛋白质的提取和分离。2019/12/214其主要原因有两个：一是被分离对象－蛋白质等在40-50℃便不稳定，开始变性，而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性；二是萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。因此研究和开发易于工业化的、高效的生化物质分离方法己成为当务之急。反胶束萃取法就是在这一背景下发展起来的一种新型分离技术。2019/12/215反胶团溶液的概念：反胶团溶液是透明的、热力学稳定的系统。反胶团是两性表面活性剂分散于非极性有机相中亲水性基团自发形成的内含微小水滴的、空间尺度仅为纳米级的聚集体。所以表面活性剂是反胶束溶液形成的关键。反胶团萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点；反胶团萃取还有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质(胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题；由于构成反胶团的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。可见，反胶团萃取技术为蛋白质的分离提取开辟了一条具有工业开发前景的新途径。优点：2019/12/217第二节反胶团的形成2019/12/218一、反胶团的构造•具有分子识别并允许选择性透过的半透膜功能；•在疏水性环境中具有使亲水性大分子保持活性功能。2019/12/219•将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶团浓度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶团，称为正常胶团(normalmicelle)。•在胶团中，表面活性剂的排列方向是极性基团在外，与水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心、在此核心可以溶解非极性物质。2019/12/2110•若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶团浓度(CMC)，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶团，其结构示意见图b。在反胶团中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核(po1arcore)。2019/12/2111•此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池”(waterpool)。当含有此种反胶团的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”。•由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。蛋白质的溶解过程和溶解后的情况示意于图中。2019/12/2112bacC增溶、乳化、润湿、杀菌、去污、起泡和消泡等二、表面活性剂（一）表面活性剂的概念表面张力：一种使表面分子具有向内运动的趋势，并使表面自动收缩至最小面积的力,现象见图1。表面活性：使液体表面张力下降的性质。表面活性物质：能使液体表面张力下降的物质。表面活性剂：具有很强的表面活性、能够显著降低液体表面张力的物质。图1荷叶上的水珠的表面张力作用现象OOOOOOOO（肥皂R——COO-）（二）结构特征亲油的非极性烃链亲水的极性基团双亲性分子结构长度不少于8个碳原子羧酸磺酸硫酸及其盐或羟基酰胺基等（三）表面活性剂的分类阴离子表面活性剂阳离子表面活性剂两性离子表面活性剂非离子表面活性剂1．阴离子表面活性剂（1）肥皂类通式（RCOO－）nMn+（2）硫酸化物通式ROSO3－M+（3）磺酸化物通式RSO3－M+碱金属皂：O/W碱土金属皂：W/O有机胺皂：三乙醇胺皂硫酸化蓖麻油、月桂醇硫酸钠、十六烷基硫酸钠等阿洛索-OT、十二烷基苯磺酸钠、甘胆酸钠等良好的乳化能力，但易被酸破坏，一般供外用乳化能力很强，较稳定。主要用作外用软膏的乳化剂渗透力强，去污力强，为优良洗涤剂2．阳离子表面活性剂3．两性离子表面活性剂通式[RNH3]＋X－主要有苯扎氯铵和苯扎溴铵（新洁尔灭）等。碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质，具有很好的起泡、去污作用；酸性溶液中则呈阳离子表面活性剂的性质，具有很强的杀菌能力。天然品卵磷脂合成品氨基酸型与甜菜碱型。脂肪酸甘油酯脂肪酸山梨坦（司盘、Span）聚山梨酯（吐温、Tween)聚氧乙烯脂肪酸酯（卖泽、Myrij）聚氧乙烯脂肪醇醚（苄泽、Brij）聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物（泊洛沙姆、Poloxamer）商品名为普流罗尼克（Pluronic）4．非离子表面活性剂主要用作W/O型辅助乳化剂HLB值：1.8～8.6W/O型乳化剂HLB值：﹥8增溶剂、润湿剂、O/W型乳化剂HLB值较高，作增溶剂、O/W型乳化剂Poloxamer188系O/W型乳化剂，可用于静脉乳剂2019/12/2120表面活性剂表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲油憎水的非极性基团两部分组成的两性分子，可分为阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，它们都可用于形成反胶团。常用的表面活性剂及相应的有机溶剂见表2019/12/2121在反胶束萃取蛋白质的研究中，用得最多的是阴离子表面活性剂AOT(AerosolOT)，其化学名为丁二酸－2－乙基己基酯磺酸钠，结构式见图2019/12/2122这种表面活性剂容易获得，其特点是具有双链，极性基团较小、形成反胶束时不需加助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子蛋白质进入。2019/12/2123(1)CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴常使用的阳离子表面活性剂名称和结构如下：2019/12/2124(2)DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲铵2019/12/2125(3)TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲铵将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶团时，与AOT不同，还需加入一定量的助溶剂(助表面活性剂)。这是因为它们在结构上的差异造成的。2019/12/2126三、反胶团的物理化学特征及制备•1.反胶团的物理化学特征2019/12/2127临界胶团浓度(CriticalMicelleConcentrationCMC)临界胶团浓度,是胶团形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示，这是体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关。CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变(如表面张力、渗透压等)来确定。由于实验方法不同，所得的CMC值往往难于完全一致，但是突变点总是落在一个很窄的浓度范围内，故用CMC范围来表示更为方便。2019/12/2128反胶团的含水率W•W＝C水/C表W越大，表示反胶团的半径越大。2019/12/21292.反胶团的制备•注入法：将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性有机溶剂中，然后进行搅拌直到形成透明的溶液。过程快，较好的控制反胶团的直径和含水量。•相转移法：将含有蛋白质的水相与含有表面活性剂的有机相接触，在缓慢的搅拌一部分蛋白质转入有机相。过程较慢，可在有机溶剂相中获得较高的蛋白质溶液。•溶解法：将含有反胶团的有机溶剂与蛋白质粉末一起搅拌，使蛋白质进入反胶团。对非水溶性蛋白质可用此法。2019/12/2130第二节生理活性物质的分离浓缩2019/12/2131bacC是有机相—水相间的分配萃取，是从主体水相向溶解于有机溶剂相中纳米级、均一且稳定的、分散的反胶团微水相中的分配。2019/12/2132bc特点：萃取进入有机相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，避免了与有机溶剂相直接接触而引起的变性、失活；同时反胶团微水相体积最多仅占有机相的几个百分点，是一个浓缩的过程。2019/12/2133反胶团的溶解作用由于反胶团内存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。因此，反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。2019/12/2134四种反胶团溶解蛋白质模型(a)为水壳模型，蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁(表面活性剂)隔开；(b)蛋白质分子表面存在强烈疏水区域，该疏水区域直接与有机相接触；(c)蛋白质吸附于反胶团内壁；(d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。2019/12/2135•表面性质不同的蛋白质可能以不同的形式溶解于反胶团相，但对于亲水性蛋白质，目前普遍接受的是水壳模型。bcda反胶团的溶解作用2019/12/2137•反胶团有哪些有用的特征可用于生物物质的分离？•将反胶团萃取技术与其他蛋白质分离技术相比较，指出它们各自的适用场合？•影响反胶束萃取蛋白质的主要因素？学习要求2019/12/2138从毛发中提取胱氨酸•胱氨酸是白色六角形板状晶体或结晶粉末，不溶于乙醇、乙醚，难溶于水。易溶于酸、碱溶液，但在热碱溶液中可被分解。•胱氨酸比半胱氨酸稳定，在体内转变成半胱氨酸后参与蛋白质合成和各种代谢过程，有促进毛发生长和防止皮肤老化等作用。2019/12/2139•临床上用于治疗膀胱炎、各种秃发症、肝炎、神经痛、中毒性病症、放射损伤以及各种原因引起的巨细胞减少症，并是治疗一些药物中毒等的特效药。在食品工业、生化及营养学研究领域也有广泛的应用。•胱氨酸存在于人发、猪毛、羊毛、马毛、羽毛及动物角等的蛋白质中，其中人发含量最高，达17.6％。胱氨酸是氨基酸中最难溶于水的一种，因此可利用这种特性，通过酸性水解，从废杂猪毛、人发、鸡毛、羊毛等角蛋白中，分离提取胱氨酸。常规提取工艺上清液（回收氨基酸）废杂毛（猪毛、人发等）清洗干燥废杂毛水解水解液中和胱氨酸粗品提纯沉淀物（粗品）滤液（弃去）结晶精制干燥精品2019/12/2141操作步骤•清洗：除去废杂毛内混杂的泥沙、石块、草木、铁杂物等，用60°C左右的热水，加少量洗涤剂，搅拌洗涤4～6分钟，洗去吸附在杂毛上的油脂，然后捞出，再用清水冲洗干净，滤干，放在通风处晒干或烘干备用。2019/12/2142•按废杂毛的量，先量取2倍30％工业盐酸，加入到玻璃钢或搪瓷水解罐中，通蒸气加热到70～80℃，立即投入已清洗晒干的废杂毛适量，继续加热，间隙搅拌，使温度均匀。•升温到100°C时开始记温，每隔半小时记温1次，在1～1.5小时内升温至110℃左右(即罐温)，以后继续维持罐压14.7千帕(气压490千帕)，水解13个小时左右(用玻璃钢盘管加热，水解时间可缩短为6～7小时)，水解期间要有回流装置，保证水解酸度，使水解更完全。水解时间可从水解罐内溶液温度达100°C时计算起。水解：2019/12/2143•水解完全后，停止回流(回收的盐酸可重用)，立即趁热过滤。这时过滤很困难，应先用玻璃布抽滤除去大的黑腐质，然后再用双层纱布抽滤，将滤液移到中和锅或缸中，滤液用1:1的盐酸冲洗2～3次，冲洗液一并倒入中和锅或缸内，准备中和。2019/12/2144•将过滤好的滤液趁热在搅拌下加入浓度30％～40％氢氧化钠(工业烧碱)溶液，当中和到pH值达4.0时，停止加碱液，然后改用醋酸钠饱和溶液中和到pH值为4.8左右，停止搅拌，静置10～12小时，用涤纶布过滤沉淀物，甩干或吊干(抽滤液可供回收谷氨酸或制备化学酱油)，即得粗品。中和时温度应保持在50℃左右，而且要在半小时内完成。中和：2019/12/2145•称取适量的胱氨酸粗品，加入粗品量13％～14％的工业盐酸(浓度为30％)，搅拌30分钟左右，等粗品全部溶解后，再加入活性炭粉(按每100千克粗品加4～5千克活性炭粉投料)，加热到90～98℃，在此温度下恒温搅拌2～3小时。然后过滤脱色液(回收活性炭粉，再生后可重用)，滤液加热到80～85℃，在搅拌下加入浓度30％氢氧化钠溶液，调节pH值至4.8时，停止加碱液