生物工程下游技术实验讲义

1生物工程下游技术实验讲义目录实验一层析柱装填及柱效测定实验二溶菌酶粗提取实验三溶菌酶分离纯化实验四酶活力及蛋白质浓度的测定实验五溶菌酶纯度鉴定与分子量测定1实验一层析柱装填及柱效测定一、实验目的1.掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；2.熟悉凝胶层析的一般过程；二、实验原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径短，保留值小，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分子量小的生物分子保留值大，后从柱中流出。凝胶层析常用于分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗生素等生物大分子,也可用于样品的浓缩和脱盐及测定生物大分子的分子质量等方面。三、实验试剂与器材层析柱（1.6×30cm），砝码天平，玻璃棒，烧杯，刻度试管及试管架，滴头吸管，SephadexG-50，0.02mol/LpH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂），水浴锅，蓝色葡聚糖四、实验内容与步骤（一）测量层析柱的内径、高度，计算所需凝胶量干胶用量（g）=柱床体积（ml）/凝胶的溶胀体积(ml/g)由上式计算出的干胶用量再增加10%-20%（二）SephadexG-50凝胶预处理2称取相应质量的干凝胶，加入适量的0.02mol/LPBS在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。（三）层析柱的装填1清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。2安装与检查：检查柱下部烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。3.关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的缓冲液4、边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉降，并不断加入凝胶液，最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2-3cm高的缓冲液，关闭出水口。5、柱子装好后，用缓冲液平衡柱子。用15ml洗脱剂走柱子使柱床稳定(流速0.5～1mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体。（注意不能干柱、分层、否则需重新装柱）（四）凝胶柱柱效测定1肉眼观察，柱子填装是否均匀，无纹路，无气泡2用0.5ml2mg/mL的蓝色葡聚糖-2000上柱，如果色带狭窄、平整、均匀下降，表明柱中的凝胶填装情况较好，可以用来进行样品分离。如果色带分散，歪曲，则需重新装柱。（五）凝胶再生鉴定完毕，打开出水口，继续用２～３倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。五、注意事项1.装柱要均匀，既不过松，也不过紧，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。2.始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。3.所用凝胶比较昂贵，需小心操作，实验后回收，尽量避免浪费和损失六、背景资料凝胶层析的使用（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管,柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用20-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。3由于层析柱的直径大小不影响分离度，所以样品量大时可用大直径的层析柱(一般制备用凝胶柱，直径大于2cm,但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上)。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1m。⑴分组分离时用短柱，一般凝胶柱长20－30cm，柱高与直径的比较5:1─10:1，样品溶液体积应小于凝胶床体积为的20%。⑵分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1（层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000），样品溶液体积应小于凝胶床体积为的5%。⑶脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的20-25%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。（二）凝胶的类型常用凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。具体的种类型号及性能列表如下：种类及主要用途化学组成部分型号颗粒大小（/目数）分离性能（Da）溶胀时间/h20-25℃90-100℃葡聚糖凝胶（SephadexG-）由葡聚糖和甘油基通过醚桥交联而成G-10100-200＜70031G-15120-200＜150031G-2550-400100-5,00031G-5050-400500-30,00031G-75120-4001,000-8,000243G-100120-4001,000-15,000723G-150120-4001,000-30000725G-200120-4001,000-60,000725聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gelp-）由丙烯酰胺和双丙烯酰胺共聚而成P-250-400200-1,80042P-450-400800-4,00042P-650-4001,000-6,00042P-1050-4001,500-20,000424P-3050-2002,500-40,000123P-6050-2003,000-60,000123P-10050-2005,000-100,000245P-15050-20015,000-150,000245P-20050-20050,000-20,000485P-30050-20060,000-400,000485琼脂糖凝胶（Sepharosegio-gel）由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接而成，为中性琼脂糖A0.5m50-400＜10,000-500,000A1.5m50-400＜10,000-1,500,000A5m50-40010,000-5,000,000A15m50-40010,000-15,000,000A50m50-400100,000-50,000,000A150m50-2001,000,000-150,000,000（三）凝胶的选择根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-200的吸水量为20，1克SephadexG─200吸水后形成的凝胶体积约40mL。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的SephadexG-200效果好；脱盐用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。（四）凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大加速膨胀，通常1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。（五）样品溶液的处理样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短柱除去。样品的粘度不能太大，否则影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。（六）防止微生物的污染交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：（1）叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20℃时约为40%。它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影5响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析特性，但可干扰荧光标记蛋白质。（2）可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。（3）乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.01%。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。（4）苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001%-0.01%。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。（六）凝胶回收如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。6实验二溶菌酶的粗提取一、实验目的1.掌握等电点沉淀法进行初级分离的操作方法和注意事项；2.能针对不同的目标产物选择恰当的初级分离方法，锻炼应用生物分离技术知识分析、解决实际问题的能力。二、实验原理溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰胞壁酸间的β-1，4糖苷键，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50℃，最适PH为6～7左右。溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取。溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点法粗分离。三、实验试剂与器材721型分光光度计、摇床、高速离心机，200mL烧杯、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、200mL量筒、50mL离心管，鸡蛋一个、0.02mol/LPBS(pH8.0),40%甘油四、实验步骤溶菌酶的粗提取（约两个半小时）1.拿1个鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中，轻轻搅拌5分钟，使其的稠度均匀，去除脐带和蛋壳。记录其体积V12.加入1.5倍体积的pH8.0PBS缓冲液，搅拌均匀3.用冰醋酸调pH4.7左右，充分搅拌4.3500rpm，离心20min,弃沉淀，转移上清至烧杯中5.加入1倍体积的pH8.0PBS缓冲液，搅拌均匀，并用5mol/LNaOH调pH8.06.滤纸过滤，取清液，测量并记录体积V27.取0.5ml蛋清于EP管中，装两管，-20℃冻存备用（样品S1）8.剩余清液装在烧杯中-20℃冻存备用。注：保存样品需明确标记名称、班级、组号、日期。五、实验注意事项71.等电点沉淀后利用离心的办法，要尽量除去沉淀；2.调节pH时要避免局部过酸；3.提取过程中尽量避免泡沫的产生。实验三溶菌酶分离纯化一、实验目的1.掌握离子层析的原理以及离子交换层析的操作方法2.掌握离子交换树脂的再生和保存二、实验原理离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。当pH较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多;在pH较高时，蛋白质的电性与低pH时相反。当蛋白质所处的pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的pH称为等电点。离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等