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生物工业专题讲座结课论文题目：基因治疗概论学号：08042208姓名：刘迪洲基因治疗概论摘要：随着在细胞分子水平上对疾病发病机制认识的深入，基因治疗已成为目前医学分子生物学员重要的研究领域之一。人类基因治疗最初着眼于遗传病。1990年开始对腺苷酸脱氨酶(ADA)缺陷所致的先天性免疫缺陷综合征进行体细胞基因治疗并初见成效。随着基因治疗基础研究的不断突破，现在基因治疗不仅用于治疗多种遗传病(如血友病等)，也已用于治疗恶性肿瘤、某些传染病(如艾滋病)、心血管疾病和糖尿病等的治疗。今后临床基因治疗的应用范围符会进一步扩大。关键词：基因治疗病毒载体非病毒载体外源基因1.前言人类疾病的发生，其实都是人体细胞中自身基因的改变或由外源病原体的基因产物与人体基因相互作用的结果。因此长期以来，科学家设想人类能否最终运用遗传物质，无论是人类自身的或是外源遗传物质来治疗疾病，纠正人体本身基因结构或功能上的错乱，阻止病菌的侵染，杀死病变的细胞或抑制外源病原体遗传物质的复制，保证人体健康。作为一种新的治疗手段，基因治疗为许多疑难病症的治疗带来了希望，在临床疾病治疗中有着极大的发展潜力。然而，基因治疗还存在着许多问题和困难，其中一些在目前还是难以逾越的障碍。因此，在了解基因治疗的原理和应用前景的同时，也应了解各种基因治疗面临的问题和困难，对基因治疗的现状和发展前景应该有一个正确的认识。[2]2.基因治疗的概念基因治疗(genetherapy)是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。在基因治疗研究的早期，基因治疗是指将目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因组发生整合，成为宿主遗传物质的一部分，目的基因表达产物起到对疾病的治疗作用。随着基因治疗基础研究的发展，治疗研究的技术不断增加，研究内容也不断扩展．不仅可以将外源性正常基因导人到病变细胞中，替代或与缺陷基因共存，产生正常基因表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质，而且可以采用适当的技术抑制细胞内过盛表达的基因，达到治疗疾病的目的；还可以将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物，达到治疗疾病的目的；也可以向功能或生物学特性异常的细胞中导入细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。在这些治疗研究中，所应用的目的基因就像临床上使用的药物一样，在治疗中发挥作用。[1]3.主要途径基因治疗主要有exvivo和invivo两条途径3.1.exvivo途径这是指将含有外源基因的载体在体外导入人体自身或异体（异种）细胞，这种细胞被称为“基因工程化的细胞”，经体外细胞扩增后输回人体。这种方法易于操作，而且因为细胞扩增过程中对外源添加物质的大量稀释，不容易产生不良反应。同时，治疗中用的是人体细胞，尤其是字体细胞，安全性好。但是，这种方法不易形成规模，而且必须有固定的临床基地。3.2.invivo途径这是将外源基因装配与特定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。这种载体可以是病毒型或者非病毒型，甚至是裸DNA。这种方式非常有利于大规模工业化生产。但是，对这种方式导入的治疗基因以及其载体必须证明其安全性，而且导入体内之后必须能进入靶细胞，有效地表达并达到治疗目的。因此，在技术上要求很高，其难度明显高于exvivo模式。4.病毒载体用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1.携带外源基因并能装配成病毒颗粒。2.介导外源基因的转移和表达3.对机体没有致病力。因为大多数野生型病毒对机体都具有致病性，需要对其进行改造后才能被用于人体。理论上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体，但由于病毒的多样性及与机体之间复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生发展的关系等的认识还很不全面，从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。到目前为止，只有少数几种病毒如反转录病毒、腺病毒及腺病毒伴随病毒，疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)等被成功地改造成为基因转移载体。4.1.病毒载体的产生研究病毒载体首先首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好在获得病毒基因组全序列信息的基础上进行。病毒基因组可分为编码区和非编码区，编码区的序列产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白。根据其对病毒的感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺势作用元件。各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的产度有一定的限制。一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105%~110%。最简单的办法是将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。有科学家将4.5kb的lacZ基因表达盒插入HSV-1病毒的UL-44（编码糖蛋白C）基因的XbaI位点中，构建成重组HSV病毒。由于UL44基因产物对于HSN在培养细胞中产毒性感染是非必需的，因此，该重组病毒可以在细胞中增值传代。用这种重组病毒颗粒感染细胞，发现lacZ基因能进入细胞并得到高效表达。[4]然而，这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先，许多野生型病毒可通过在细胞中的复制而导致细胞裂解死亡，或带有病毒癌基因而是细胞发生转化，必须经过改造使其成为缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次，插入外源DNA的长度受到很大限制，尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒（4.7kb）、反转录病毒（8~10kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就很小，要删除更多的病毒基因以腾出空间插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量，出了删除病毒的非必需基因外，还可以进一步删去部分或全部必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或宿主细胞提供。[3]4.2.病毒载体的分类（1）重组型病毒载体这类载体以完整的病毒基因组为改造对象，在不改变病毒复制和包装所需的顺式作用元件的情况下，有选择性的删除病毒的某些必需基因，尤其是前早期或早期基因以控制其表达，所缺失的必需基因的功能由同时导入细胞中的外源基因表达单位提供。一般通过同源重组方法将目的基因插入到病毒基因组中。（2）无病毒基因的病毒载体这类载体可以看做是重组病毒载体的一种极端减毒情况，往往由重组载体和辅助系统组成。重组载体主要由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作用元件及载体骨架组成。辅助系统包括病毒复制和包装所必需的所有反式作用元件。在辅助系统的作用下，重组载体以特定形式（单链或双链DNA或RNA）被包装到不含有任何病毒基因的病毒颗粒中。这类载体的优点在于载体病毒本身安全性好，容量大。缺点在于往往需要辅助病毒参与载体DNA的包装，造成终产品中辅助病毒污染，影响其应用。4.3.病毒载体在基因治疗中的应用据比完全统计，自1990年开展第一例人体基因治疗以来，已进行了数百项基因治疗临床试验，涉及患者上千人，其中2/3以上的临床方案应用了病毒载体进行基因导入。不同的病毒载体具有特定的生物学功能，决定了其在基因治疗中的应用，下表列举了常用的病毒载体的特性和适用范围。病毒载体生物学特性适用范围反转录病毒载体可感染分裂细胞exvivo基因治疗整合到染色体中表达时间较长肿瘤基因治疗有致癌危险腺病毒载体可感染分裂和非分裂细胞invivo基因治疗不整合到染色体中外源基因表达水平高肿瘤基因治疗表达时间较短疫苗免疫原性强腺病毒伴随病毒载体可感染分裂和非分裂细胞invivo基因治疗整合到染色体中无致病性，免疫原性强exvivo基因治疗可长期表达外源基因在骨骼肌、心肌、肝、视网膜等组织中表达水平较高遗传病基因治疗、获得性慢性疾病的基因治疗疱病毒载体具嗜神经性，可逆轴突传递神经系统疾病的基因治疗可潜伏感染容量大肿瘤的基因治疗可感染分裂和非分裂细胞5．非病毒载体病毒载体存在不足，主要体现在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备复杂及费用较高等。现在，人们愈来愈重视人工合成的非病毒载体的研究。目前常用的非病毒载体包括裸DNA、脂质体载体及阳离子多聚物型载体等。5.1.裸DNA裸DNA，又称自由DNA，是结构最简单的非病毒载体。使用裸DNA进行基因治疗的最大困难在于如何将目的基因导入相应的细胞并得到有效而长期的表达。主要通过物理或机械方法（如直接注射或基因枪法）将DNA导入适当部位（如皮肤、骨骼肌、肝、支气管内。心肌和瘤体里）。当用于激发免疫反应时又称为DNA疫苗，是一种非常有希望的疫苗方式。基因枪方法又叫微粒轰击技术，它采用能将自发吸收DNA的钨或金属粒，通过高压电所产生的高能电弧促使DNA包裹着的金属粒产生极高的速度，有效穿透单细胞层或靶器官从而将DNA导入培养细胞或动物组织中。裸DNA虽能有效运转并表达目的基因，但缺乏靶向性，并且只能在局部作用，不能转染大量细胞，经常需要进行外科手术以暴露靶器官，使用局限性较大。5.2.脂质体/DNA复合物脂质体是具有双层膜的封闭式粒子，他们促进极性大分子穿透细胞膜。根据脂质体包裹DNA的方式不同可将脂质体分为阳离子脂质体、阴离子脂质体、PH敏感脂质体及融合脂质体等。阳离子脂质体是目前最常用的脂质类型，它主要由带正电荷的脂质及中性辅助脂质组成，两者通常是等物质的量混合。由于电荷的相互作用，阳性电荷的脂质体和带负电荷的DNA直接可以有效地形成复合物，制备时只需将两者直接混合形成复合物，不受基因体积大小的限制。脂质的化学结构、组成对载体的活性和毒性有很大影响。具有多个正电荷头部的脂质体转染率高，这可能是因为它与DNA结合更牢固。脂质体在酸性环境中与细胞膜结合能力大大降低，在细胞间的转运也取决于脂质体中类脂的成分。DC-Chol/DOPE阳离子脂质体是第一个被批准用于人体的脂质体。由于制备技术的不稳定性，对靶细胞的毒性和试剂价格较贵等原因，其应用受到了一定的限制。细胞摄取脂质体主要通过内吞途径，脂质体与其内含物遇到溶酶体即被溶解。PH敏感脂质体可在一定程度上避免溶酶体降解并增加DNA摄取量和稳定性。PH敏感脂质体的原理是酸性条件下脂肪酸羧基质子化，形成六角晶相发生膜融合。在形成内吞小泡进入溶酶体之前，由于PH从7.4降至5.3~6.3，PH敏感脂质体与内吞小泡膜融合，将内含物导入胞质。这类脂质体主要由二油酰胆碱（DOPE）、胆固醇和油酸以4:4:2（物质的量比）组成，脂质成分中常用的DOPE决定了脂质体在中性条件下的稳定性和酸性条件下与细胞融合的能力。PH敏感脂质体虽然通过静电吸附与细胞膜产生非特异性相互作用，转运效率比普通脂质体高，但实际上也只有10%的基因释放至细胞质中，其余仍在溶酶体中降解。5.3多聚物/DNA复合物由于DNA带负电，利用阳离子多聚体的氨基基团的正电荷与DNA的磷酸基团结合发生电性中和，可以使DNA缩合形成稳定的多聚复合物，不易被核酸酶降解，并可以防止沉淀，从而提高转染效率。此外，复合体大小约80~100nm，带正电荷，可与细胞表面带负电荷的受体结合，因此能有效的被内吞摄入，介导基因转移。常见的阳离子多聚体有多聚左旋赖氨酸、鱼精蛋白、组蛋白、多聚乙胺、多聚乙烯亚胺和星状树突体等，可以分别形成线型、分支型、球型或类球体状结构。虽然多聚阳离子型载体系统具有合成比较方便、安全无毒的特点，但是，单独使用多聚阳离子同样具有基因转移组织特异性和靶向性差、体内基因转移效率较低等缺点，有待进一步改善和提高。5.4.DNA微球体白明胶和聚氨基葡萄糖等生物高聚物属阳离子复合物，能与DNA形成大小为200~750nm的微球体复合物。白明胶和聚氨基葡萄糖等有如下特点：①他们是可降解的生物材料；②DNA可均一的分布在微球体中，免于被DNA酶降解；③可与活性物质共包装达到靶向运输增加了基因治疗的可能性；④储存方便稳定；⑤可以达到可控持释放，延长了基因表达时间；⑥毒性低。[5]6.基因治疗中的问题基因治疗要取得突破，必须在基因导入系统、基因表达的可控性及获得更多更好的治疗基因这三方面下功夫。（1）靶向性基因导入系统基因治疗中的关键问题是必须将治疗基因送入特定的靶细胞，并在该细