生物技术之层析技术.

引言1850年德国科学家朗格首先发现了色谱分离的现象，当他把一种有颜色的物质滴到一张滤纸上，观察到它们扩散成一圈一圈的圆环。层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家茨维特（MichaelTswett）发现并命名的。他将碳酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物叶子的色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤，于是奇迹出现了，在吸附柱的不同部位出现了绿色的叶绿素，黄色的叶黄素和胡萝卜素，混合物的不同色素组分得到了分离。当时茨维特把这种色带叫作“色谱”，茨维特把他开创的方法叫色谱法（Chromatography)。4层析技术（chromatography）又称色谱技术、层离技术等，是一组相关技术的总称。层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。5层析技术具有分离精度高、设备简单、操作方便等优点，样品可多可少，既可用于实验室的研究工作，又可用于工业生产，还可与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。层析技术是当前获得高纯度产物最有效的分离纯化技术。6主要内容第一节概述第二节凝胶层析技术第三节离子交换层析技术第四节吸附层析技术第五节亲和层析技术7第一节概述一、基本概念层析系统：任何层析过程都是在两个相中进行的，一个是固定于支持物上的固定相，另一个是流经固定相的流动相，层析系统就是由固定相和流动相组成的。当流动相流过加有样品的固定相时，由于样品中各组分的理化性质的差异，受固定相的阻力与流动相的推力的影响不同，因而各组分在固定相与流动相之间的分布（含量对比）不同，从而使各组分以不同的速率移动，达到分离物质的目的。8第一节概述配合相应的光学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定量和纯化某种物质，其纯度高达99%。固定相固定相是由层析介质组成。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），但这个液体必须附载在某个固体物质上，该物质称为载体或担体（support）。这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。9基本概念流动相在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。固定相与流动相，两相互不相溶10层析法是基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使混合物中各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，并使各组分以不同速率移动，从而达到分离的目的。二、基本原理11柱层析系统的基本组成层析柱+层析剂上样洗脱系统检测系统收集系统三通阀收集器检测器泵泵流动相料液DCBA层析柱（a）层析系统基本组成12时间（或流出体体积）流出组分浓度ABCD①层析剂选择和预处理②装柱③平衡④上样⑤洗脱⑥检测⑦收集⑧层析剂再生和保存柱层析的基本操作（b）分离出组分峰图(1)分辨力高(2)分析效率高(3)灵敏度高(4)操作简便，应用广泛局限性：在定量分析中需要纯制得标准物质；不能精确地解决物质的化学结构问题三、层析法的特点气-固(GSC)气-液(GLC)液-固(LSC)液-液(LLC)1.按流动相的形式不同气相层析GC液相层析LC以气体作为流动相以液体作为流动相四、层析技术分类2.按层析的原理可分为吸附层析分配层析凝胶层析亲和层析离子交换层析层析技术分类3.按操作形式不同柱层析平面层析：包括纸层析、薄层层析、薄膜层析等层析技术分类是将固定相装在柱内，使样品沿一个方向移动，以达到分离目的。是用滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，使组分达到分离。是将适当粒度的固定相均匀涂铺在薄板上。点样后，用流动相展开，使组分达到分离。是将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析的方法进行物质的分离。17第二节常用的层析方法凝胶层析离子交换层析亲和层析吸附层析分配层析（一）凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤法等。——是指混合物随流动相流经装有凝胶作固定相的层析柱时，混合物中各种物质因分子大小不同而被分离纯化的技术。凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗粒，颗粒内部不是实心的，而是三维多孔网状结构。1.凝胶层析的原理固定相（凝胶）——三维空间网状结构凝胶层析法样品固定相流动相小分子被延滯小分子大分子较快流出分子筛效应：分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。在洗脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因其直径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快，先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网状结构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度慢，比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因此得到分离。1.凝胶层析的原理凝胶层析不同大小的分子流过多孔凝胶→→分子大的组分先流出，分子小的组分后流出→→各组分便按分子从大到小的顺序依次流出2.凝胶层析的介质凝胶是一种多孔网状结构物质。层析用的凝胶一般都呈球形，颗粒的大小通常以目数来表示。层析的分辨率和流速与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般常用的是100~200目。目前常用的有交联葡聚糖凝胶，交联琼脂糖凝胶，丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶以及Superdex。27是最传统的凝胶介质。由天然高分子葡聚糖与其它交联剂(3-氯-1,2环氧丙烷)交联而成的凝胶。国外商品名为Sephadex。主要由PharmaciaBiotech生产。常见的有三类：——SephadexG系列、SephacrylS系列和SephadexLH系列。（1）葡聚糖凝胶：结构：基本骨架：葡聚糖（dextran）交联剂：3-氯代-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构。葡聚糖凝胶：凝胶型号与交联度、吸水量的关系：交联度：如SephadexG25,G50,G100,数字越小，交联度越大，凝胶网状结构越紧密。吸水量与数字关系：如G25，表示吸水量为1g干胶吸水2.5g.29（2）琼脂糖凝胶交联琼脂糖凝胶是由琼脂糖与1,3-二溴异丙醇交联而成的多孔网状结构。商品名为SepharoseCL。此类产品通常有Sepharose2B、Sepharose4B、Sepharose6B三种，分别代表含琼脂糖凝胶2%、4%、6%的凝胶。该凝胶具有良好的机械性能，分辨率高，分离范围广，广泛用于蛋白质的分离纯化和亲和层析的载体。30（3）聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联而成。商品名为Bio-Gel。改变亚甲基双丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。pH为2~11之间比较稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影响L;非常亲水，基本不带电荷，吸附效应较小,流速快，分辨率高。不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。丙烯酰胺凝胶商品型号有Bio-gelP-2到Bio-gelP-300等10种，其阿拉伯数字表示排阻极限。由丙烯酰基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺共聚生成的刚性凝胶，化学性质稳定，有良好的机械性能，可高温消毒，分辨率高，广泛用于蛋白质的分离与提纯。（4）Sephacryl凝胶：一种由Phamarica公司生产的新型凝胶过滤介质，有高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成，是目前分辨率和选择性最高的凝胶过滤介质。其物理化学性质稳定，能耐受强去垢剂与变性剂的影响，可高温消毒，流速快，分辨率高。现有Superdex30Superdex75Superdex200三种型号。（5）Superdex：(1)生物大分子的纯化(2)分子量测定(3)脱盐及去除小分子杂质3.凝胶层析的应用凝胶层析的优点(1)凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。(2)操作条件较温和。(3)样品得率高，重复性好，可进行大量样品的分离纯化。凝胶层析的缺点(1)要求样品和洗脱液的粘度很低。(2)凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。(3)凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。4.凝胶层析的特点（二）离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相。利用其对需要分离的各种离子结合力的差异而将混合物中的不同离子进行分离的层析技术。此法广泛应用于很多生化物质(例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等)的分析、制备、纯化，以及溶液的中和、脱色等方面。离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离离子型混合物的层析方法。——依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化。1.离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理离子交换剂——不溶于水的带有电荷基团的惰性高分子聚合物。包括基质、电荷基团(或功能基团)和反离子三部分。离子交换剂的基质是一类具有特殊网状立体结构的聚合物颗粒，其物理化学性质稳定，不溶于水和许多有机溶剂。基质上交联有较多的酸性或碱性基团，这些酸性或碱性基团通过静电作用可结合带相反电荷的离子（反离子）。当流动相中存在带电荷的离子时，就可与先结合在离子交换剂上的反离子进行可逆的交换。纤维素—O—CH2—COO-—Na+纤维素阳离子交换剂组成示意图根据可交换离子的性质，离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂：交联酸性基团，能和流动相中的阳离子交换。例如：R-SO3-H++Na+→R-SO3-Na++H+胶体胶体阴离子交换剂：交联碱性基团，能和流动相中的阴离子交换。例如：R-N+(CH3)3OH-+Cl-→R-N+(CH3)3Cl-+OH-离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理示意图++++———++++++++++—+++流动相中，不同离子化合物带电荷数量不同，与离子交换剂相互作用的强弱也不同。因此，可以通过提高流动相中的离子强度或改变pH值得方法，将结合在离子交换剂上的反离子从离子交换柱上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。离子交换层析的基本原理带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来；带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于等电点(pI)时，它们带正电荷能与阳离子交换剂结合；反之，pH高于pI时，它们带负电荷能与阴离子交换剂结合。pH与pI的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。离子交换层析的基本原理离子交换层析的基本原理2.离子交换剂通过化学方法将酸性或碱性基团交联在惰性基质上可获得离子交换剂。常用的基质有纤维素，葡聚糖凝胶，交联琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。根据交换基团酸碱性的强弱，阳离子交换剂又分为强酸型和弱酸型，阴离子交换剂又分为强碱型和弱碱型。在实际工作中，可根据被分离的物质的性质，选用适当类型的离子交换剂。分离碱性蛋白质常用阳离子交换剂，分离酸性蛋白质常用阴离子交换剂。分离蛋白质样品时一般常用弱型交换剂。离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。强酸性(阳性)离子交换剂对H＋的结合力比对Na＋的小；强碱性(阴性)离子交换剂对OH－的结合力比对Cl－的小得多；弱酸性离子交换剂对H＋的结合力远比对Na＋的大；弱碱性离子交换剂对OH－的结合力比对Cl－的大。离子交换剂低盐高盐分离结束3.洗脱在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通