生物技术制药

第一章生物技术制药总论1、现代生物制药的研究内容应包括：基因工程制药；细胞工程制药；酶工程制药；发酵工程制药；蛋白质工程制药。2、生物药物主要有蛋白质、核酸、糖类、脂类等。3、限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。（是非题）4、基因工程制药的基本步骤主要由三大部分组成，即上游技术，下有技术和质量控制。（1）上游技术1、目的基因的获取2、构建DNA重组体3、DNA重组体转入宿主菌4、阳性工程菌株的筛选（2）下游技术1、工程菌发酵表达2、表达产物的分离纯化工艺（3）质量控制1、结构组成、各种理化、生化性质。2、安全性、稳定性和生物活性。第二章基因工程制药1、基因工程制药:获取目的基因、目的基因的重组、构建表达系统、培养工程菌。2、大肠杆菌表达系统是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌。3、λ噬菌体能够携带的外源DNA片段长度较大，而且其感染能力也大于质粒转化细菌的能力，所以λ噬菌体一直被作为基因组文库和cDNA文库的克隆载体。4、α-互补法（蓝白菌落）5、以包涵体形式存在的蛋白质分子不具有正确的天然三维结构，表达蛋白不具有生物活性，因此在纯化过程中必须溶解包涵体并对表达蛋白进行复性。6、菌体细胞的收集与破碎中的化学方法最常用的是碱和表面活性剂，碱可以有效地释放菌体中的蛋白质，缺点是引起目的蛋白的不可逆变性。（是非题）7、周质表达蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达之间的一种表达形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中的蛋白质杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离纯化。第三章细胞工程制药1、体细胞重编程指的是分化的体细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能的状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程。2、细胞融合技术是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。3、核移植技术是将1个动物的细胞核移植到卵细胞中发育生长。4、植物细胞的全能性植物细胞经过分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性。植物细胞只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在适当的条件下可以通过分裂、分化再生成一个完整的植株。第四章酶工程制药1、酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的生物大分子，分为蛋白酶类和核酸酶类这两类酶分子中起催化作用的主要成分分别是蛋白质和核酸。2、酶催化反应具有以下特点：专一性强，效率高，条件温和。3、药用生产酶的方法主要有提取分离法（Extraction）、生物合成法(Biosynthesis)以及化学合成法(Chemicalsynthesis)。4、大肠杆菌最早用于酶生产细胞。5、固定化酶最大特点：既具有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂的作用。6、固定化酶的优点？（1）可多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高。（2）反应后，酶与底物和产物分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量提高。（3）反应条件易于控制，可以实现转化反应的连续化和自动化控制。（4）没的利用效率高，单位酶的催化的底物量增加，用酶量减少。（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。7、催化抗体是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，因此催化抗体也叫抗体酶。8、抗体酶与天然酶相比其优势在于？（1）抗体酶有更强的专一性和稳定性（2）抗体酶能催化那些天然酶不能催化的反应（3）不仅提供了人工生物催化剂，而且提供了研究生物催化过程的新途径第五章发酵工程制药1、发酵工艺设计的关键技术是对微生物代谢调控的研究。2、在制药微生物的培养基中，除了水、氧气、碳源、氮源、无机盐及微量元素、生长因子等一般微生物生长所必须营养外，有时还需要在培养基中加入一些促进药物产物合成的物质，如前体、诱导物、促进剂与抑制剂。3、药物高产菌株或分泌新型特效药物菌株的选育包括了自然选育和人工选育两种方法，后者又分为诱变育种、杂交育种和基因工程育种等方法。4、微生物的发酵过程分批发酵生长周期——生长阶段（1）延迟期（2）指数生长期（3）指数生长期（4）静止期（5）衰亡期第六章蛋白质工程制药1、蛋白质工程制药的核心内容就是收集大量的蛋白质分子结构的信息。三维空间结构的测定是炎症蛋白质设计的假设即证明是新的结构改变了原有的生物功能的必须手段。2、国外许多研究机构正在致力于研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发具有高度专一性的药用蛋白。3、蛋白质定向进化技术（directedevolution）它不需要事先了解蛋白质的三维结构及作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），是基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能的蛋白质，从而在几天或几周内实现自然界需要几百万年才能完成的事情。4、易错PCR利用缺乏修复功能的Taq酶，并设置容易引起出错的PCR反应条件，在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。优点：简便易行基本原理：通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，或使用低保真度的DNA聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错误引入而创造序列多样性文库。它一般适用于片段小于1000bp的基因。5、DNA改组技术(DNAshuffling)通过对目的基因酶切成随机片段，然后进行PCR重聚，由于同源重组而产生基因突变的方法。6、基因家族改组技术（DNAfamilyshuffling）此方法与基因改组技术最大的区别在于出发序列的同源性。第九章治疗性抗体药物1、抗体机体受抗原刺激后由B淋巴细胞产生，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。2、抗体的基本结构（1）Y字形的四肽链结构（2）两条完全相同的重链（3）两条完全相同的轻链（4）以二硫键连接3、抗体和免疫球蛋白的区别（1）免疫球蛋白：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白（2）抗体：机体受抗原刺激后由B淋巴细胞产生，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。（3）抗体都是免疫球蛋白（4）免疫球蛋白不一定都具有抗体活性4、抗原决定簇抗原分子中与淋巴细胞表面的抗原受体相结合的部位5、B细胞在受抗原刺激和增殖分化的过程中，最初几代只合成IgM抗体。（是非题）6、尽管抗体药物效果让人如此期待，并有很多已上市，但销量却不大，原因？（1）完整抗体药物需要糖基化修饰，而糖基化抗体需要由哺乳动物细胞表达产生，技术含量和生产成本都较高。（2）完整抗体药物在临床上的用药量较大，治疗费用也会随之增加。7、▲试述治疗化小型抗体的研发必要与研发方向？（1）抗体药物的小型化（2）抗体药物的高效化8、抗体分子由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，具有典型的功能结构，其余抗原的结合完全取决于氨基端的可变区。9、抗体分子的功能结构特点又使得嵌合抗体的构建相对比较容易，因为各功能区形成相对独立的空间构象，使得恒定区置换操作较简单可行。10、嵌合抗体的制备（1）可变区基因的克隆重组（2）表达载体的构建（3）嵌合抗体的表达11、人鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。第十章治疗性细胞株1、干细胞是一种具有多分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞，它能在人体内分化成任何细胞类型。2、胚胎干细胞（embryonicstemcells）：具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。3、成体干细胞(adultstemcells)：具有多能性，即到了个体发育的一定阶段甚至成体，仍有一部分细胞分化，负责组织的更新和修复。位于成体组织和器官的未分化细胞，具有分化成功能细胞和组织的潜能，但却失去了发育成个体的能力，起维持和修复其所在组织的作用。4、人体胚胎干细胞的特性：（1）永生化（2）有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化（3）能维持稳定的二倍体染色体结构（4）具有全能性5、治疗性克隆和生殖性克隆的区别？生殖性克隆通过将克隆的人类胚胎种植母体，导致克隆人的产生；而治疗性克隆利用胚胎干细胞克隆人体器官或组织，以供医学研究和临床治疗使用。6、核移植是建立在核移植技术与胚胎干细胞技术的基础上。7、胚胎干细胞系细胞（embryonicstemcells,ES）具有全能性，既具有分化发育为构成机体任何一部分组织器官的能力。第十一章细胞因子类药物1、细胞因子（cytokine）是机体各种细胞分泌的，具有免疫、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节细胞增殖、分化和生理活性并参与病理反应等多种作用的多肽类或蛋白质。是除免疫球蛋白和补体之外的另一类免疫因子。2、细胞因子类药物的特点？（1）细胞因子通过结合细胞表面的相应受体发挥作用（2）细胞因子具有高活性（3）细胞因子具有多功能（4）细胞因子具有低分子量3、细胞因子通常由淋巴细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等相关细胞产生。4、IFN的不良反应（1）发热初次用药时常出现高热现象，以后逐渐减轻或消失。（2）感冒样综合征治疗2~3次后逐渐减轻。对感冒样综合症可于注射后2h，给扑热息痛等热镇痛剂对症处理，不必停药。（3）骨髓抑制严密观察血象变化，必要时需停药。（4）神经系统症状出现抑郁及神经病症状应停药。（5）癫痫、肾病综合征、间质性肺炎和心律失常等应停药（6）诱发自身免疫性疾病如甲状腺炎、血小板减少性紫癜、溶血性贫血、风湿性关节炎、红斑狼疮样综合征、血管炎综合症和I型糖尿病等，停药后可减轻症状。5、促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是第一个被发现并应用于临床的造血生长因子，主要生理作用是促进红细胞生成。6、EPO也是反兴奋剂检测中最主要的项目之一。第十二章基因治疗1、基因转移方法：用适当的方法将外源目的基因导入体内或体外细胞的过程。2、常用的基因转移方法有非病毒介导和病毒介导两大类。前者又分为物理法（裸DNA直接注射法、颗粒轰击法、显微注射法、电穿孔法、超声波法）、化学法（磷酸钙共沉淀法、二乙胺乙基葡聚糖法）和融合发（脂质体介导法、阳离子多聚物法、原生质体融合法），后者包括逆转录病毒载体介导法、腺相关病毒介导法及单纯疱疹病毒载体介导法等。3、腺病毒载体缺点：（1）不能整合到靶细胞的基因组DNA中，分裂增殖快的细胞导入重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。（2）宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。（3）有两个环节可能产生复制性腺病毒腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒巨细胞病毒发生重组。4、靶向差异性（特异性差）5、DNA缺乏症被选为第一个基因治疗试验的原因？（1）单基因遗传病，功能清晰，基因小（2）基因调控简单，只要“开启”状态（3）ADA酶量无需精确调控：很少量的酶也可以使患者受益，没量很多也能耐受。6、基因失活的种类（填空题）（1）反义RNA（antisenseRNA）（2）干扰RNA(RNAinterference)（3）核酶（ribozyme）7、靶细胞的选择需考虑什么？（1）最好为组织特异性细胞（2）细胞较易获得，且生命周期长（3）离体细胞较易受外源基因转化（4）离体细胞经转染和一定时间培养后在植回体内，仍较易成活8、逆转录病毒载体的特点（1）逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效进入靶细胞。（2）逆转录病毒结构基因gag、ene和pol的缺失不影响其他部位的活性。（3）前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。（4）包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。9、逆转录病毒载体的主要缺点（是非题）（1）随机整合有插入突变、激活癌基因的风险（2）逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7kb以下的外源基因10、人工脂质体膜具有如下特点：（1）与体细胞相容，无毒性和免疫原性（2）可生物降解，不会在体内堆积（3）可制成球状（0.03~50um），包容大小不同的生物活性分子（4）可带有不同的电荷（5）具有不同的膜脂流动性、稳定性