生物技术制药第2版第三章动物细胞制药

第三章动物细胞工程制药参考教材1.《生物技术制药》夏焕章高等教育出版社2.《生物技术制药》王凤山人民卫生出版社3.《生物技术制药概论》姚文兵中国医药科技出版社22019/12/21第一节概述第二节动物细胞的体外培养第三节动物细胞的培养条件和培养基第四节动物细胞培养的基本方法第五节生产用动物细胞的要求和获得第六节动物细胞大规模培养的方法和操作方式第七节动物细胞生物反应器第八节动物细胞产品的纯化方法和质量要求第九节动物细胞制药的前景与展望本章内容2019/12/213学习要求：掌握：动物细胞培养的基本要求、培养基的种类及主要组成；生产用细胞的要求及获得方法。熟悉：生产用动物细胞的种类，动物细胞大规模培养的主要方法和操作方式。了解：动物细胞生物反应器的基本知识，动物细胞制药的发展前景。42019/12/21第一节概述一、动物细胞培养的历史二、细胞工程学三、动物细胞制药发展历史2019/12/215动物细胞工程制药两大内容：在无菌和人工控制的条件下培养动物细胞以获得多肽和蛋白质药物；按照预定的设计，根据细胞生物学及工程学原理，采用遗传操作技术定向改造动物细胞及动物细胞的遗传性状，利用转基因动物或转基因动物细胞生产疫苗、多肽和蛋白质。已成为生物制药最重要的组成部分之一2019/12/216基因重组细胞组织培养或细胞培养：将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机体体内的生理条件进行培养，使之生存和生长。一、动物细胞培养的历史2019/12/217动物细胞体外培养历史上的里程碑1885年德国Roux生理盐水培养鸡胚神经板组织，首次提出“tissueculture”1897年Loeb从血液和结缔组织中分离细胞可在血清和血浆中存活1903年Jolly观察到蝾螈细胞在体外可进行分裂1907年Harrison无菌条件下培养了离体的蛙胚神经组织，观察到神经细胞突起的生长过程；并在实验中整理出一套合理的无菌操作技术，被公认为组织培养之父1923年Carrel发明了卡式瓶培养法，将鸡胚的心肌组织持续培养了34年。2019/12/21820世纪50年代，各种培养操作技术、培养器皿和培养基孕育而生。Earle首创单个细胞克隆培养方法，建立了可无限传代的C3H小鼠结缔组织细胞系。1951年，Gay建立了第一个上皮型细胞系——人宫颈癌Hela细胞系。1957年，Dulbecco采用胰酶消化处理组织块，用液体培养的方法获得了单层细胞，开创了真正意义上的动物细胞培养技术。1962年，Capstick成功大规模悬浮培养小鼠肾细胞，标志着动物细胞大规模培养技术的起步。1975年，Kohler和Milstein成功融合小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞。动物细胞体外培养历史上的里程碑2019/12/219细胞工程：以细胞为单位，按照人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或生产新品种的目的，使细胞增加或重新获得产生某些特定产物的能力，并提取出对人类有用的产品。P79二、细胞工程学2019/12/2110细胞工程学（Cellularengineering）Cellularengineeringincludestissueengineeringandbioprocessengineering.Tissueengineeringinvolvestheuseoflivingcellsinthedevelopmentofbiologicalsubstitutesfortherestorationorreplacementoffunction.Bioprocessengineeringuseoflivingcellstomanufactureabiochemicalproduct,e.g.,throughtheuseofrecombinantDNAtechnology.Asbiomedicalengineeringhasexpandedtoincludethecellularlevel,andbioprocessengineeringhasshiftedininterestfrommicrobialorganismstoincludemammaliancells,thereareintellectualissuesinwhichaninterestissharedbythesetwoformerlyseparateareasofengineeringactivity.2019/12/2111细胞工程学细胞工程(cellularengineering)包括生物医学工程（biomedicalengineering）及生物工艺工程（bioprocessengineering）生物医学工程由组织工程（tissueengineering）发展而来，指运用活细胞开发生物再生物或功能替代物，由器官和组织培养发展至细胞乃至亚细胞培养。生物工艺工程是运用活细胞制造生物医学产物，通常是运用重组DNA技术。由微生物向哺乳动物细胞转移二者交叉于细胞培养技术，形成共性的知识产权由这两个领域分享。122019/12/21组织工程：利用生物活性物质，通过体外培养或构建的方法，再造或者修复器官及组织的技术。在体外进行细胞培养，让细胞增殖，从而再造器官。2019/12/2113VacantiMouse：人耳鼠2019/12/2114三、动物细胞制药的发展历史1949年，Enders及其同事用哺乳动物原代细胞生产灭活脊髓灰质炎病毒疫苗，开创了先河。1986年用淋巴母细胞Namalwa生产干扰素批准用于临床。此后，Vero细胞生产狂苗和脊髓灰质炎疫苗大量应用。1987年，杂交瘤细胞培养OKT3单抗批准用于临床。1988年之后一大批用转化细胞生产的重组基因产品陆续批准上市，标志着动物细胞制药新型产业的形成。如今，动物细胞工程制药在生物制药的研究和应用中起关键作用，投放市场及临床试验中的重组蛋白有70%来自哺乳动物细胞培养。2019/12/2115细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。动物细胞用于生物制品生产可进行翻译后修饰、正确的切割折叠。蛋白正确折叠、二硫键形成、多聚化、蛋白酶加工、磷酸化、充分糖基化（内质网、高尔基体）广泛应用于生物制品生产疫苗：乙肝疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰质炎疫苗、乙脑疫苗细胞因子：干扰素、EPO、凝血因子VIII等单克隆抗体及抗体类融合蛋白：OKT3、Herceptin、Avastin、Erbitux，Rituximab、Humira等2019/12/21162019/12/21FDA批准的抗体药物全抗体37个（至2014.10月）抗体片段3个ADC3个（1个已撤市）双特异抗体2个Fc融合蛋白7个鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2000Mylotarg2001Campath2002ZevalinHumira2003XolairBexxar2004AvastinErbitux2006LucentisVectibix2007Soliris2008Cimzia2009StelaraSinponi2010ActemraNumax2011BenlystaYervoyAdcetris2012PerjetaEylea2013KadcylaGazyva2014CyramzaSylvantEntyvioKeytruda第二节动物细胞的体外培养一、体外培养细胞的类型二、动物细胞的化学组成和代谢三、动物细胞的培养特性2019/12/2118离体培养细胞分类贴壁细胞悬浮细胞兼性贴壁细胞2019/12/21191.贴壁细胞（非淋巴组织细胞、异倍体细胞）生长须有可贴附的支持物表面，依靠自身分泌或培养基中提供的贴附因子在表面上生长。两种形态：上皮细胞型细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肺泡上皮等皆呈上皮型形态。胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。2019/12/2120成纤维细胞型生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如来源于淋巴的细胞。2.悬浮细胞（血液、淋巴细胞、杂交瘤细胞）2019/12/21213.兼性贴壁细胞（CHO、L929、BHK）兼具上述两种生长方式。中国仓鼠卵巢细胞CHO和小鼠肺纤维瘤L929细胞：当贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时呈圆形。2019/12/2122二、动物细胞的化学组成和代谢1.动物细胞的化学组成蛋白质、糖类、脂类、核酸、水、无机盐。2.动物细胞的代谢糖酵解、三羧酸循环2019/12/2123三、动物细胞的培养特性1.细胞的分裂周期长2019/12/21242.多数细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象接触抑制（contactinhibition）：细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加。有：大多数细胞无：少数悬浮培养细胞、癌细胞2019/12/2125动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶1代细胞原代培养50代细胞传代培养无限传代？单个细胞加培养液3.正常二倍体细胞的生长寿命是有限的2019/12/21264.动物细胞具有环境敏感性动物细胞与植物细胞和微生物细胞相比培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。动物细胞对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活（渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素）。2019/12/2127必需氨基酸维生素无机盐和微量元素葡萄糖细胞生长因子、贴壁因子等5.动物细胞对培养基要求高2019/12/2128动物细胞蛋白质的合成部位：游离核糖体与粗面内质网结合的核糖体游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白，多为糖蛋白（N-链寡糖、O-链寡糖）。6.动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。2019/12/21292019/12/21302019/12/21317.胞外分泌，纯化方便；翻译后修饰（糖基化），与天然产品一致。2019/12/2132动物细胞培养的环境条件动物细胞营养要求培养基和其他常用液体洁净及无菌适宜的培养环境充足营养第三节动物细胞的培养条件和培养基2019/12/2133动物细胞培养的环境条件（一）防止污染洁净间器皿和器材水（二）培养条件pH渗透压培养温度空气基本营养物质2019/12/2134（一）防止污染1.洁净室/无菌室：（1）定期打扫无菌室：清洁与消毒；（2）CO2培养箱、摇床灭菌（先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射）。（3）实验前灭菌：打开紫外灯、空气净化器系统各20-30分钟（4）实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。动物细胞培养的环境条件2019/12/21352.器材的清洗和消毒玻璃器械洗消，初次使用需酸泡金属器皿（不能泡酸）举例：布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃,15磅,20分钟，然后在烘箱中烘干；培养液、平衡盐溶液液体：121℃,15磅,20分钟；玻璃瓶：干热灭菌170℃,4小时。2019/12/21362019/12/2137自动双重纯水蒸馏器纯水仪注射水制水设备3.水——清洗、配制培养液超纯水：电阻值大于18MΩ，去内毒素。2019/12/2138无毒、无污染体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力，因此培养基应达到：无化学物质污染