生物技术在中药鉴定方面的应用

生物技术在中药鉴定方面的应用浙江理工大学生命科学学院，浙江杭州310018摘要现代生物技术是以现代生物学和生命科学为基础，按照所研究的层次不同，可以分为酶工程、发酵工程、细胞工程、基因工程、蛋白质工程等五大类，核心是基因工程。我国药材资源丰富,药用动植物约1万余种。但目前使用的药材来源复杂,互混、互代、掺假现象普遍存在因此对各种药材进行准确鉴定显得十分必要。近年来，随着生物科学的飞速发展，许多新学科理论和实验技术不断的被运用到中药的鉴定当中，以确保中药使用更安全有效。关键词中药鉴定PAGE技术RAPD技术DNA序列分析生物芯片中药鉴定学研究的主要内容是中药材及基原鉴定，包括鉴定方法和鉴定标准。鉴定的方法有很多，生物方法有分子鉴定，化学方法鉴定技术有红外光谱鉴定、色谱鉴定，形态鉴定技术有仿生技术。现从生物技术角度主要介绍蛋白标记技术和基于PCR的DNA分子鉴定技术。1蛋白质标记技术1.1聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中药材中含有多种组分，如有机酸、蛋白质、生物碱和酶等，其电荷和分子量和分子结构大不相同。在电场作用下，经一定时间，各组泳动的方向、速度和距离也不同，采用电泳技术进行蛋白质谱带数目、宽窄、位置及染色程度分析，可以获得很多信息从而达到中药鉴别的目的[1]。该方法操作方便，设备简单，分辨率高，尤其对种子类药材有很好的鉴别作用。赵华英等应用PAGE技术，对6种外形相似的苋科种子类药材青箱子、牛膝子、鸡冠花子、邹果苋子、苋子、反枝苋子之间进行了可溶性蛋白质电泳分析，电泳图谱显示各样品特征带，可以准确区分各种药材，鉴别真伪，在临床用药时保证用药安全[2]。2DNA分子鉴定2.1随机引物扩增多态性(randomamplifiedpolymor2phicDNA,RAPD)技术RAPD技术在PCR技术的基础上发展于20世纪90年代,是用人工合成的较短的单个随机引物,以药材总DNA为模板,在DNA聚合酶作用下,进行非特异性的聚合酶链式反应,分析扩增产物电泳图谱在不同类群中的变异,扩增片段具有品种、品系及单株特异性。RAPD技术主要用中药混淆品、代替品的鉴定，多来源中药的鉴定，动物类中药的鉴定，道地药材的鉴定[3]。任冰如等用RAPD技术对南、北苍术不同居群间的亲缘关系作了鉴定，从DNA水平上证实了南、北苍术亲缘关系很近,差异很小,所以南、北苍术并非是两个不同的种，应将北苍术定为南苍术的变种[4]。徐朝晖等在用TCL法不能有效区分的情况下,成功地用该技术将牛蒡子及其5种常易混淆的伪品毛头牛蒡、大翅蓟、水飞蓟、云木香和紫穗槐的果实区分开来[5]。2.2DNA序列分析由于中药的加工和储存过程不利于DNA的保存,DNA指纹图谱分析手段较为困难,该方法以待测样品进行PCR扩增,对扩增片段测序，提高了DNA序列分析的效率[6]。吴平等对龟的线粒体12SrRNA基因片段进行扩增,然后测定扩增产物的序列。通过这种方法,他们构建了21种龟类的12SrRNA基因片段序列数据库,成功地将乌龟与其它混淆品种区分开来。王建云[7]等对鸡内金线粒体Cytb进行PCR扩增反应测序,将鸡内金与鸭内金区分了开来。他们还用该法鉴定了鹿鞭、牛鞭和驴鞭。2.3生物芯片技术(biologicalchip)生物芯片是基于信息、材料、机械、微电子等学科的应用发展背景下发展起来的一项高新技术产业[8]。生物芯片主要包括基因芯片(genechip)和肽芯片(peptidechip),是指将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子(DNA、RNA、多肽等)固定于支持物(膜、玻璃片、硅片等)上后与标记的样品分子进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度,对样品分子进行定性、定量和结构分析,其原理是利用生物大分子具有的特异相互识别能力[9]。相较于色谱指纹图谱分析的方法具快速、准确、高通量和自动化的优点。李绍平等对川贝母、浙贝母、皖贝母和湖北贝母等4种主要贝母品种5S2rRNA的序列分析时发现,川贝母有一特异性的碱基序列CTTTTGTCGCATCA,以此序列为探针制成芯片,将待测样品提取DNA并经扩增和荧光标记后与芯片上探针进行杂交,然后通过荧光检测即可准确鉴定出川贝母。宋沁馨等利用PCR扩增反应和电泳芯片鉴别人参、西洋参以及两种样本的混合物[10]。该研究根据人参、西洋参内转录间隔区和5.8s基因上的单核苷酸多态性位点设计特异性引物，进行PCR扩增反应，产物用灵敏度较高的芯片电泳法进行分离和检测。该鉴别检测反应特异性高、重现性好、操作简便，能准确鉴别人参和西洋参，并成功用于市场上参类药材、切片及胶囊的鉴别。参考文献[1]杨洪鸣，李真玉，唐金宝.现代生物技术在中药鉴定中的作用.中国药师2004；（7）：811[2]赵华英，陈永林.苋科6种种子类药材的蛋白电泳鉴别.中中药杂志2000；25（1）:53-53[3]刘娟，张春晖.RAPD技术在中药领域的应用及其发展前景.黑龙江医药科学2006;29(6):92[4]任冰如，贺善安，於红，等.用RAPD技术评估苍术居群间的亲缘关系.中草药2000；31（6）：458[5]徐朝晖，涂为，杨松松，等.RAPD法结合TLC鉴别中药牛蒡子及其混淆品.中草药2000；31（6）：455[6]詹秀琴,王明艳.分子生物学技术在中药鉴定中的应用及探讨.生物学通报2001;36(11)∶3—4.ZhanXQ,WangMY.Applicationandstudyofmolecularbio2logicaltechnologyinidentificationoftraditionalChinesemedicine.BullBiol2001;36(11)∶3—4.[7]王建云，王文，宿兵，等.DNA序列分析技术鉴定鸡内金的方法学研究.中国药科大学学报.1996；27(8)：471-475[8]李绍平，李萍，董婷霞，等.生物芯片技术在中药鉴定研究中的应用与展望.世界科学技术.2000:15[9]杨美香，刘德山，曲迅.生物芯片技术在中药研究中的意义.中医中药.2004；10（4）：251[10]宋沁馨，冯芳，张心悦，等.SNP测定结合芯片电泳法快速鉴别人参和西洋参.药物分析杂志.2009；29（1）：1