生物技术在帕金森病中的应用

1、生物技术在帕金森病诊断和治疗中的应用近年来随着人口老龄化的发展，帕金森病的发病率也呈上升趋势。帕金森病的主要是黒质多巴胺能神经元的进行性变性死亡、残存神经元DA合成能力降低，导致纹状体DA神经递质的不足，从而对锥体外系的运动调节功能失调。目前普遍认为PD是有多种因素导致的，在遗传、环境及衰老等多因素的相互作用下，通过线粒体功能衰竭、氧化应激、免疫异常、细胞调亡、钙超载等机制，致黑质多巴胺能神经元大量变性丢失而发病。生物技术在帕金森病中的诊断线粒体功能衰竭：目前认为线粒体功能缺陷的原因与线粒体基因组的异常相关。多个实验已证实PD患者中线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)突变明显高于正常人，证实mtDNA损伤是复合体工功能缺陷的关键因素，参与编码complex工基因的多态性与PD的易感性有关。所以可以利用生物技术将PD患者的线粒体与线粒体缺失的正常细胞融合，检测complex工活性。若活性下降很大，则说明是PD患者。氧化应激：目前多数研究者认为氧化应激是黑质多巴胺能神经元选择性损伤的关键因素，黑质DA能神经元的生理生化特点，极易处于氧化应激状态。过氧化氢酶和GSH-pX都是自由基的有效清除剂，可以灭活自由基使细胞免受氧化损伤。PD病人的黑质中过氧化氢酶和GSH-Px含量轻度减少。所以可以利用生物技术方法检测病人黑质中过氧化氢酶和GSH-Px的含量。免疫异常：在PD患者脑中，小胶质细胞异常激活，主要分布于死亡的DA能神经元周围。小胶质细胞的激活可促进反应性氧化物(H2O2,O2-,NO,等)和毒性细胞因子(TNF-a、IL-1β、IL-6、IFN-y等)的释放，引起氧化应激和线粒体功能障碍，加重神经元的损伤。小胶质细胞的激活还可使金属基质蛋白酶的表达显著增加，降解细胞外基质成分，对神经元膜的结构和功能造成破坏。所以可以利用生物技术手段检测反应性氧化物、毒性细胞因子和金属基质蛋白酶的含量是否超标。细胞凋亡：细胞凋亡是多巴胺神经元选择性和进行性丢失的主要形式。以往的研究已证实线粒体机制诱发的凋亡在PD中的作用，即氧化应激可诱导前凋亡蛋白Bax的表达并转位至线粒体外膜，线粒体膜通透性增高，释放出凋亡诱导因子(A工F)和细胞色素C。AIF可独立作用于核染色质，引起DNA降解和染色质凝缩。释放至胞质的细胞色素C则与其他蛋白共同作用激活caspase蛋白酶级联反应，水解一系列底物，引起细胞凋亡。最近的研究表明过度的内质网应激诱发的细胞凋亡，作为一种新的凋亡信号转导通路与许多神经变性疾病包括帕金森病相关。所以可以利用生物技术手段检测凋亡诱导因子和细胞色素C含量是否超标，同时检测染色质是否凝缩。钙超载：钙的耗竭等因素可诱发内质网应激反应，启动相关机制维持细胞稳态。但过度的反应诱发了特异性的凋亡途径，使caspase-12裂解活化，激活下游效应分子，介导凋亡。内质网应激也可促发细胞色素C的释放，与线粒体凋亡间存在协同作用。所以可以利用生物技术手段检测caspase-12以及细胞色素C含量是否超标。生物技术在帕金森病中的治疗对于细胞凋亡因素，显示过量表达Bcl-2的小鼠对MPTP诱导的神经毒性是有抵抗性的。在几个相似的研究中，也证明caspase-1的抑制、bax缺陷和p53敲除的小鼠都有对MPTP一诱导的神经毒性有抵抗力。所以可以利用生物技术手段提高Bcl-2基因的表达，降低Bax基因表达，发挥神经保护作用。抗凋亡治疗是一种有效的方法，对PD和HD的动物模型研究表明抗凋亡治疗可减少细胞死亡。该方法的优点是可以不受PD或HD中发生神经退行性变的原因的限制。神经营养因子作为神经保护剂的作用机制主要是抗细胞毒性损伤。营养因子可抗神经兴奋性毒性损伤和抗氧化应激，并能改善线粒体的功能。它们能够上调钙阻抑蛋白、抗氧化酶和抗凋亡信号。神经毒性损伤过程往往会继发细胞内钙离子水平升高进而引起线粒体功能障碍，自由基大量产生、凋亡过程激活和许多破坏性蛋白酶与脂酶的活化。神经营养因子通过作用于细胞内钙超载蛋白，可以提高细胞对钙内流的耐受进而提高细胞的存活。所以我们可以从动物身上找到调控神经营养因子的基因利用生物技术手段进行克隆然后转接到PD患者体内进行表达用来治疗帕金森病，这将具有很大应用前景。2、生物技术在凋亡细胞机制中的应用细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,结束其生命的生理性死亡，是受基因严格调控的细胞自杀现象。凋亡过程中，细胞骨架蛋白分解—细胞和细胞器浓缩而不裂解—染色体DNA断裂和形成凋亡小体—细胞内含物不外泄，不引起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。哺乳动物的细胞凋亡是由Bcl-2家族蛋白、调节蛋白Apaf-1(凋亡激酶激活因子1）caspase家族调控的。Bcl-2家族包括两类成员，一类如Bcl-2Bcl-xl等抑制凋亡发生，另一类如BaxBakBcl-xsBadBidBik等促进凋亡发生。Bcl一2位于线粒体外膜，Bcl一2的表达可显著地抑制过氧化物及自由基增加所诱导的细胞凋亡。Bax可以形成线粒体通透性转移孔，而细胞色素C可从此孔中逃逸进入胞浆，其与Apaf1和Procaspase9等形成凋亡小体，然后激活caspase3形成凋亡基质。Bax蛋白既能和Bcl一2形成异源二聚体使Bcl一2蛋白失活，对细胞凋亡有促进作用，又可以自身形成同源二聚体，直接促进凋亡。如果Bax等促进凋亡的分子占了上风，则细胞就会发生凋亡。反之，细胞受到保护。如果使Bcl-2基因过量表达将会有效抵制细胞的凋亡。有研究也证明caspase-1的抑制、bax缺陷和p53敲除的小鼠都有对细胞凋亡有一定的抵制作用。所以可以利用生物技术手段提高Bcl-2基因的表达，降低Bax基因表达，敲除p53基因，将会有效抑制细胞的凋亡。对基因做过处理后检测细胞凋亡和之前是否用差异。细胞凋亡的检测一、细胞凋亡的形态学检测1、光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。三、DNA片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段。大分子染色体DNA片段的测定细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大片段。其不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术。四、Caspase-3活性检测Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。1、Westernblot分析分析Procaspase-3，活化的Caspase-3及其对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。五、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体2、在微定量板上吸附抗组蛋白抗体3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合4、加辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合5、加酶的底物，测光吸收。