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植物与氮素营养的关系及氨基酸转运蛋白的分类摘要：氮素是陆地生态系统中植物生长发育必需的元素，氨基酸作为植物体内重要的有机氮化合物在植物生长代谢中起着非常重要的作用，氨基酸转运蛋白是位于生物膜上转运氨基酸的蛋白家族，主要由归属于两个超家族的八个亚家族成员构成，家族成员的氨基酸残基数在400～650之间，含有8-14个不等的跨膜结构域。本论文收集氨基酸转运蛋白家族成员的序列信息进行系统发育及保守性研究，并针对部分有代表性的成员进行了序列的分析和结构的预测。氨基酸转运蛋白被划分为8个亚家族，在亚细胞结构中的分布存在较大的差异。关键词：氮；乔木；基因组；序列分析；生物信息一、氮的重要性氮是植物生长发育过程中必需的大量元素之一，其对作物最终产量的贡献高达40%-50%，是植物体内蛋白质、核酸、磷脂和一些生长激素的重要组成部分。植物体内的氮素水平直接或间接的影响着植物的光合作用：氮元素不仅作为叶绿素的重要组成，也在暗反应中通过影响关键酶活性对碳同化速率产生影响；同时，氮元素可以NO的形式作为信号分子可以参与植物生长发育过程的调控[1]。地球上大部分氮元素存在于岩石圈和大气圈中。在大气中，以分子态氮为主的惰性气体占到大气总量的78%；土壤中的氮元素主要以硝酸盐的形式存在。环境中的氮元素大部分不能够被植物直接利用，需要通过微生物的生物化学反应转化为可利用的形式被植物吸收。氮素是植物生长发育所必须的营养元素，也是提高生产能力的主要限制因子，由此，增加土壤的氮肥力和研究植物氮同化途径来提高植物的氮利用率就显得尤为重要。目前，氮肥的利用效率较低，仅30%，且氮肥的过量使用造成的负面影响也愈演愈烈，因此，从植物代谢的角度增加氮的利用率就显得尤为重要。许多乔木品种是泛原生态环境中的多年生森林植物，其生活环境由于地表径流的作用导致氮元素无法被充分利用，因此，对于乔木物种来说，氮素营养对其有相对其他物种更为重要的作用。二、氮素循环在自然界，氮元素以分子态（氮气）、无机的化合态氮和有机的化合态氮三种形式存在。大气中含有大量的分子态氮，但是绝大多数生物都不能够利用分子态的氮，只有像豆科植物的根瘤菌一类的细菌和某些蓝绿藻能够将大气中的氮气转变为硝态氮（硝酸盐）加以利用。岩石和矿物中的氮被风化后进入土壤，一部分被生物体吸收，一部分被地表径流带入海洋。海洋接纳了来自土壤和大气的氮，其中的一部分被生物体吸收。生物体死后，生物体内的氮一部分以挥发性氮化合物的形式进入大气，一部分又返回土壤，还有一部分以沉积物的形式沉积在大洋深处。植物只能从土壤中吸收无机态的铵态氮（铵盐）和硝态氮（硝酸盐），用来合成氨基酸，再进一步合成各种蛋白质。动物则只能直接或间接利用植物合成的有机态氮（蛋白质），经分解成为氨基酸后再合成自身的蛋白质。在动物的代谢过程中，一部分蛋白质被分解为氨、尿酸和尿素等排出体外，最终进入土壤。动植物的残体中的有机氮则被微生物转化为无机氮（氨态氮和硝态氮），从而完成生态系统的氮循环。森林植物与周围环境构成的小型生态系统所具有的氮循环类型包括两个方面：开放式氮循环（opennitrogencycle）和闭合式氮循环（closednitrogencycle）。在开放的氮循环系统中，包括乔木在内的一些植物能够保持持续性的生长，即使在土壤温度不适宜氮元素的合成和吸收的情况下，植物也能够通过利用早春蓄积在体内的氮元素和叶片生长过程中果实代谢所产生的氮元素来维持自身生长[3]，因此，开放式氮循环系统不容易缺失氮元素而导致生长受阻。在闭合式的氮循环系统中，生长在极端环境中的森林植物通过限制生长来保持氮素的可利用性[4]，其氮素营养的特点有以下几个方面：（1），外部氮元素的补充少；（2），流失到外部环境中的氮元素也少；（3），由于低效率的硝化和反硝化作用，植物向体外释放的含氮气体少；（4），生态系统中大部分的氮素由植物枯枝落叶的腐蚀、矿化作用以及微生物的腐蚀提供[5]。鉴于其生态系统的特点，这类森林植物的主要N源是与具有硝化作用的根际微生物竞争得到的氨基酸和氨化合物[6]，而其生长也是季节性的。在土壤温度不适宜N素吸收时，植物体内储存的氮素营养以及代谢活动均能够支持植物的季节性生长[7]。三、植物从土壤中吸收氮元素的形式（1）无机氮的摄取当一种氮素化合物满足以下条件时，该化合物能够被植物利用：(i)氮素化合物以植物可利用的形式存在于土壤中；(ii)植物体具有能够调节的系统（转运体）来吸收该化合物；(iii)植物具有内源性代谢系统来利用该种化合物[8]。氮素吸收效率由对应的转运体的丰富程度、活动性以及根表面积决定，菌根菌的作用能够极大的促进根系吸收氮素化合物的效率[9]。植物通过根系从土壤中摄取的氮素化合物一般以铵盐和硝酸盐为主，摄取NH4+和NO3-通过转运体的转入以及转出来实现。目前，将含氮离子转出的运输机制研究较少，其可能的代谢途径有两个方面：通过离子通道运输到细胞外或通过具有转出作用的转运体蛋白被动运输到细胞外[10]。植物中有两个蛋白家族主要进行无机氮的转运，即NH4+转运蛋白（ammoniumtransporters，AMT）以及NO3-转运蛋白（nitratetransporters，NRT）两个家族，在不同植物中，两家族成员蛋白的数目有较大的差别。植物中，应用计算机预测的方式推测其含有14个不同的AMT家族成员，而在拟南芥和水稻中，AMT家族仅有6个和10个不同的成员[11]。造成这种差异的原因在于进化上产生的基因组的重复。通过系统发育分析，预测出的这些AMT家族成员可以分为两个不同的亚家族AMT1和AMT2。NRT家族成员在乔木植物中的研究较少，但在对拟南芥的研究中发现，NTR依据不同的结合效率被划分为两个基因家族：低结合率的转运蛋白归为NTR1，高结合率的转运蛋白归为NTR2[12]。由于多数基因家族成员存在于乔木种族的数量多于拟南芥和水稻，可以推测乔木种族内NTR家族的成员数目也将多于拟南芥中的11个。（2）有机氮的摄取除无机氮化合物外，土壤中还含有包括自由氨基酸、肽链和蛋白质在内的有机氮化合物，尽管氨基酸在土壤有机氮化合物中所占比例很小[13]，但诸多学者还是将对植物吸收有机氮化合物的研究重点放在了氨基酸上。对松科植物的研究发现，与无机氮化合物的吸收速率相比，植物对氨基酸的转运速率低于NH4+但高于NO3-[14]。土壤中的自由氨基酸来源于土壤微生物、菌根菌和植物根系分泌的蛋白水解酶在适宜pH条件下的蛋白水解作用[15]，但水解产生的氨基酸大部分被土壤微生物摄取吸收，仅有小部分能够被植物根系吸收利用[6]。氨基酸进入植物细胞通过质子协同运输的方式由氨基酸转运蛋白完成，即一或两个质子与一个氨基酸共同进入细胞[16]。植物全基因组研究确定了至少5个亚家族共计134个基因位点属于氨基酸转运蛋白[17]，与拟南芥67个已鉴定的氨基酸转运蛋白[2]相比，是其数目的两倍。氨基酸转运蛋白具有时间、空间表达的特异性以及酶作用底物的特异性，其功能也可能出现冗余性和基因不表达的特点[18]。四、氨基酸转运蛋白氨基酸转运蛋白在动物和植物中的种类存在差异，一般来讲，植物中的氨基酸转运蛋白分为三个大的家族：ATF（aminoacidtransporterfamily）、APC（aminoacid–polyamine–choline）和MCF（Mitochondrialcarrierfamily）。1ATF家族ATF家族是通常所指的氨基酸转运蛋白家族，也称AAAP-aminoacid/auxinpermease-family，是植物中最先报道的氨基酸转运蛋白家族。家族中包含六个亚家族：AAP亚家族、LHT亚家族、ProT亚家族、GAT亚家族、ANT亚家族以及AUX亚家族。1.1AAP亚家族Aminoacidpermeases即氨基酸通透性酶，是目前研究最多的氨基酸转运蛋白亚家族，在拟南芥中，该家族共有八个成员，其中AtAAP1到AtAAP6以及AtAAP8已被证明选择性转运中性氨基酸以及谷氨酸[19,20]。AAP家族在拟南芥中表现出了较强的组织和底物特异性，亚家族成员间的功能有由较大的区分。如AtAAP1在拟南芥子叶及胚乳中表达，在根基氮元素富集的情况下，可能将氨基酸转运至根细胞内[21]；AtAAP2在拟南芥果实的导管组织中表达，其作用可能与氨基酸长距离运输有关[22]；AtAAP3主要在根系导管组织细胞中表达，但该蛋白也在开花前的雄蕊有关短时间的表达，其功能可能与从植物韧皮部或土壤摄取氨基酸有关[23]；AtAAP5可能与筛管从营养组织运输氨基酸并将氨基酸转入正在生长的种子中有关，由于AtAAP5能够与AtLHT1协同作用对转运阳离子氨基酸起到重要作用，因此AtAAP5可能是根基摄取氨基酸系统最重要的组成成分[24]。1.2LHT亚家族Lysine/histidinetransporters即赖氨酸/组氨酸转运蛋白，研究表明，家族成员对中性和酸性氨基酸具有高的结合强度，因而采用其结合底物来命名该种氨基酸转运蛋白。以模式生物拟南芥为研究对象来研究LHT亚家族成员LHT1表明，该蛋白具有组织特异性，主要在花、幼叶以及果实中表达[25]。1.3ProT亚家族转运亚氨基脯氨酸、谷氨酸甜菜碱、相关的四氨基化合物以及α-氨基丁酸，与转运底物结合效率较为平稳或仅有较低的结合率[26]。1.4GAT亚家族γ-aminobutyricacidtransporters，即γ-氨基丁酸转运体蛋白，转运γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）以及γ-氨基丁酸相关的化合物。目前，对拟南芥GAT亚家族成员AtGAT1的研究表明，AtGAT1是一种由H+驱动的与转运底物有强结合的γ-氨基丁酸转运蛋白，除能够转运GABA外，它还能够转运ω-氨基脂肪酸和丁胺。与其他非γ-氨基丁酸转运蛋白相比，AtGAT1没有与之相似的序列组成。胁迫或敏感环境下，GABA在植物体富集，AtGAT1表达量提高，正常生活条件下，AtGAT1在花中表达量最高[27]。1.5ANT亚家族Aromaticandneutralaminoacidtransporter，芳香族和中性氨基酸转运蛋白，对芳香族氨基酸以及中性氨基酸在细胞膜的运输起作用，拟南芥AtANT1不仅能够转运芳香族和中性氨基酸，也能够转运吲哚乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸。RNA凝胶印记分析表明，AtANT1在所有组织中均能够表达，但在花和茎叶组织中表达量最高[28]。1.6AUX亚家族Auxin-resistant，生长素耐受性转运蛋白。生长素（auxin）是一种植物生长激素，在结构上与色氨酸有关，拟南芥生长素耐受性转运体AtAUX1参与生长素的转运，也参与吲哚乙酸IAA的转运[29]。ATF家族各亚家族在底物选择和结合效率上的不同说明了各家族空间表达的特异性，从侧面反映出不同家族在植物生长发育中起着特定的作用。对一些模式生物氨基酸转运蛋白系统进化的研究表明，高等植物氨基酸转运蛋白具有较强的保守性，但同源的转运蛋白在物种之间仍具有组织和表达水平的特异性。2APC家族植物中第二大氨基酸转运蛋白家族是多胺胆碱氨基酸转运体家族（aminoacidpolyaminecholine，APC）。在原核生物（真细菌和古细菌）、真核生物（寄生虫、真菌以及动物）中，该家族成员表现出相似性。植物的APC家族主要包括两个亚家族：CAT亚家族和LAT亚家族。2.1CAT亚家族Cationicaminoacidtransporters即阳离子氨基酸转运蛋白，该亚家族成员在植物中和动物中有较强的同源性，拟南芥中该家族蛋白有11-14个不等的假定跨膜区，并且都属于高结合力的碱性氨基酸转运蛋白，在细胞中主要存在于质膜和液泡膜上[30]。近期对于植物CAT家族蛋白PtCAT11的研究表明，PtCAT11能够选择性地转运谷氨酸[31]。2.2LAT亚家族L-typeaminoacidtransporters即L型氨基酸转运蛋白，也称为糖蛋白相关的氨基酸转运蛋白，其中的L型指的是异