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2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化1.文献综述绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequoreavictoria)中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国WoodsHole海洋生物学实验室的OsamuShimomura(下村修)、哥伦比亚大学的MartinChalfie和加州大学圣地亚哥分校的RogerY.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。下修村首次从Aequoreavictoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。MartinChalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。2.实验器材2.1实验材料：含GFP融合质粒，Top10菌株2.2实验试剂：质粒提取：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0；溶液Ⅱ：0.2MNaOH/1%SDS；溶液Ⅲ：3M醋酸钾/2M醋酸；无水乙醇，75%乙醇，TEBuffer；转化：0.1M预冷CaCl2，LB培养基，氨苄青霉素，阿拉伯糖；GFP提取：液氮，LysisBuffer，饱和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶；疏水作用层析柱材：苯基琼脂糖凝胶CL-4B；离子交换柱层析柱材：DEAE+纤维素，StartBuffer(A液20mMTris-HCl，pH7.0（透析液）)Elutionbuffer(B液20mMTris-HCl，1MNaCl，pH7.0)SDS-PAGE电泳：PEG10000，LoadingBuffer，溴酚蓝，丙烯酰胺，Tris，SDS，过硫酸铵，TEMED，Gly，SDS，甘油，β-巯基乙醇，溴酚蓝，甲醇，考马斯亮蓝，乙酸等2.3实验仪器高速冷冻离心机,移液枪，超声波破碎仪，梯度混合器，恒流泵,层析柱,色谱仪,自动记录仪,SDS-PAGE电泳装置。3.实验方法3.1质粒提取1.取1.5mL菌液，12000rpm离心1min，弃上清液；2.加100μL溶液Ⅰ，充分悬浮；3.加200μL溶液Ⅱ，温和混匀，室温5min；4.加150μL溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min；5.12000rpm离心8min，将上清加入一新的1.5mlEP管中；6.加800μL无水乙醇至上清液中，混匀，-20℃放置10min，12000rpm离心8min，弃上清；7.70%乙醇洗DNA一次，离心弃上清；8.在超净台中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；9.加40μLTEBuffer溶解DNA，4℃备用。3.2感受态细胞的制备以及转化1.取1.5mLTop10菌液，在4℃4000rpm离心10min，弃上清；2.加200μL预冷的0.1MCaCl2悬浮沉淀（无菌操作），冰浴15min后4℃4000rpm离心10min，弃上清；3.加200μL预冷的0.1MCaCl2悬浮沉淀（无菌操作），4℃备用；4.将1μL质粒和感受态细胞混合，冰浴30min；5.42℃热激90s；6.立即放在冰上3-5min；7.加入800μLLB液体培养基，37℃150rpm培养60min（使Top10恢复正常生长）；8.取200μL菌液涂布在LB（Amp100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培养基上，37℃培养过夜。3.3扩大培养1.取含GFP质粒的Top10平板并挑取单克隆（在紫外灯照射下有绿色荧光的菌落）；2.将挑取的单菌落接种于试管中（含4mL的LB液体培养基，100ng/ml的Amp和4mg/ml的阿拉伯糖）37℃，200rpm振荡培养至对数生长期（约3-4h）；3.将上述摇好的菌液，按1:100转接至250mLLB液中（Amp工作浓度100ng/ml，阿拉伯糖工作浓度2mg/ml），37℃，200rpm培养过夜。3.4细胞破碎1.将培养好的细菌3000g离心10min，紫外灯观察弃上清，沉淀用液氮冻融；2.用30mLLysisBuffer(50mMTris-HClpH8.0，1mMEDTA)悬浮沉淀；3.向悬浮液中加15mg溶菌酶，混匀后室温溶解10min；4.400W功率下，超声处理10min；5.将破碎液9000g离心15min，紫外灯观察，留上清备用；6.选取合适的浓度破碎(NH4)2SO4沉淀GFP；一般(NH4)2SO4饱和度为30%时，杂蛋白的沉淀量最大，饱和度达到70%时GFP沉淀量达最大附：(NH4)2SO4浓度与含量表，体积为10ml；7.向上清中加5.28g(NH4)2SO4，充分溶解，室温放置20min，9000rpm(NH4)2SO4饱和度10%20%30%40%50%60%70%80%90%(NH4)2SO4（g）0.561.141.762.433.133.94.725.616.62离心15min，转移上清至另一试管中，再加入6.88g(NH4)2SO4，充分混匀，室温放置至少20min，9000rpm离心15min，弃上清，留沉淀备用；3.5疏水作用层析1.将沉淀的GFP，用10mL2M(NH4)2SO4/LysisBuffer，pH8.0溶解，9000rpm，离心10min，留上清；（2号样品）2.用3倍体积平衡Buffer（2M(NH4)2SO4，pH8.0）平衡柱子；3.将步骤1中的上清液上柱，用3倍柱体积的WashingBuffer（1.3M(NH4)2SO4，pH8.0）洗柱子；4.用恒流泵泵TEBuffer（ElutionBuffer：10mMTris,1mMEDTA，pH8.0）洗柱，紫外灯检查，GFP快流出时，准备收集；5.将收集液透析过夜。（3号样品）3.6离子交换层析1.将透析后所得的透析液9000rpm离心10min，弃去沉淀（4）；2.用3倍体积的StartBuffer(A液)平衡柱子；3.将步骤1中所得的上清液上柱，再用3倍柱体积的StartBuffer洗柱子；4.梯度洗脱GFP，梯度液：StartBuffer(A液)、ElutionBuffer(B液)，紫外灯观察，GFP快流出来时，准备收集5.将收集液透析过夜(透析液为A液)。3.7凝胶过滤纯化GFP1.将透析袋置入含PEG10000的培养皿中，浓缩至体积约2mL；2.用3倍柱体积的20mMTris-HCl，pH7.0平衡柱子；3.将步骤1中所得的GFP上柱，用20mMTris-HCl，pH7.0洗柱子，紫外灯检测，GFP快流出时收集备用。3.8SDS—PAGE将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGELoadingBuffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清-20℃保存备用。1.按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。2.分离胶的制备按下列成分配制分离胶：各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中，并为浓缩胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层20%乙醇封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的乙醇，用滤纸吸干凝胶顶端的乙醇。3.浓缩胶的制备按下列成分配制2mL5%的积层胶：ddH2O30%丙烯酰胺混合液1.0MTris(pH6.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED7.35mL1.3mL1.25mL0.1mL0.1mL0.1mLddH2O30%丙烯酰胺混合液1.5MTris(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED8.2mL6.68mL5.0mL0.1mL0.1mL0.04mL各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其灌注到分离胶上，灌满后小心插入加样梳，尽可能避免产生气泡。4.待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。5.将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入20μL各样品。6.样品在浓缩胶中电泳时，使用80V电压，待溴酚蓝带进入分离胶后，将电压升至120V，继续电泳直至溴酚蓝带到达分离胶的底部且开始泳出胶底面，关闭电源。7.卸下凝胶，将其浸泡在至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液（50%甲醇，0.05%考马斯亮蓝，10%乙酸，40%ddH2O）中，置水平摇床上室温染色45min，之后取出凝胶并回收染色液，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液（与染色液同，只是无考马斯亮蓝）中，在水平摇床上脱色1h，其间更换脱色液3-4次，直至凝胶脱色到条带清晰为止，观察结果并拍照。（注：由于浓缩胶制备过程中凝固太快，所以最后未使用浓缩胶而只用分离胶进行SDS-PAGE。）思考题1.实验纯化效果如何？如果要得到较纯的GFP，你会采用哪些方法进一步纯化？答：实验纯化效果请见实验结果分析。2.SDS-PAGE的样品缓冲液中有哪些成分？它们有什么作用？为什么要将样品和缓冲液混合后煮沸？答：SDS-PAGE的样品缓冲液的主要成分有SDS，甘油，溴酚蓝和β-巯基乙醇，其中SDS的作用主要是使蛋白质变形，断裂蛋白质分子间和分子内的氢键，使蛋白质分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构；甘油是增加密度，使蛋白质能很好的沉淀在下面；溴酚蓝作为指示前沿，防止电泳时间过长；β-巯基乙醇作为保护剂，防止空气中的氧对蛋白质的氧化作用，同时还能断裂蛋白质分子中半胱氨酸残基中的二硫键。3.常用的交联葡聚糖有G-25、G-50、G-70其中的25、50、75指的是什么？答：交联葡聚糖G-25、G-50、G-70中的25、50、75指的是1g交联葡聚糖干胶膨胀时所吸收水克数的10倍，如G-25中的25指1g这种交联葡聚糖干胶膨胀时要吸水2.5g。4.离子交换层析后，交换剂用什么方法再生后可以继续使用？答：5.简述疏水层析的原理和主要步骤。答：蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其他方法不易纯化的蛋白质。主要步骤有：首先用高盐溶液平衡柱子，使柱子暴露出疏水基团，然后在蛋白质过柱子后，最后换用低浓度盐溶液洗脱。